【文献综述】
化学发光分析
文摘：本文系统地论述了化学发光分析的原理、分类、以及最新进展。重点综述了有机物的化学发光分析法，以及流动注射化学发光分析法。引用文献100余篇。
关键词：化学发光，流动注射分析

化学发光分析（Chemiluminescence）是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法。化学发光分析与荧光分析和磷光分析一起组成了发光分析体系。化学发光分析与分光光度法相比较，具有灵敏度高，不需要外来光源等优点，因而降低了噪音，提高了信躁比。此外，其线性范围宽（可达六个数量级）也是一个显著优点。最近几年，化学发光分析的发展主要表现在新体系的不断建立和完善、新发光试剂的研究，拓宽了发光分析的应用范围。尤其是与流动注射分析FIA（Flow Injection Analysis）、高效液相色谱HPLC（High Performance Liquid Chromatography）、传感器技术等的联用，以及多种固定化试剂技术的应用[1，2]，越发突出了化学发光分析灵敏、快速的优点。方肇伦先生对FI-CL有专门的介绍[3]。
本文将从化学发光分析的基本原理及条件、反应体系类型及应用、化学发光分析的应用前景等诸方面对其做较为完备的阐述。

1．基本原理
物质在进行化学反应时所释放出的能量为处于基态的反应物分子所吸收而跃迁至第一激发态；当返回基态时，激发态分子所吸收的能量以光子的形式辐射出来，此即称为化学发光CL（Chemiluminescence）[4]。
实际上，许多化学反应的能量传递是以吸热或放热的形式完成的，所以发光反应其实并不多见。
化学发光反应式可表示如下：
反应物A+反应物B→激发态产物C+其它产物D （1-1）
激发态产物C→基态C+光子hυ (1-2)
测定化学发光反应，一般是依据反应体系的发光强度与反应物（待测物）之浓度成正比的关系。
在某一时刻t的发光强度ICL(t)可表达如下：
ICL(t)=-фCL•dc/dt (1-3)
其中，ICL(t)为每秒发出的光子数，фCL为化学发光效率，dc/dt为每秒发生反应的分子数。
发光效率фCL，生成激活态效率фCE及激活态发光效率фEM分别定义如下[5]：
фCE=生成激活态的分子数/参加反应的分子数 （1-4）
фEM=发光的分子数/生成的激活态分子数 （1-5）
фCL=фCE•фEM =发光分子数/参加反应的分子数 （1-6）
化学发光的时间因反应体系不同而异。从不足一秒到十几分钟都有。对发光时间较短的反应，其发光强度-时间关系如图1（A）所示，符合拟一级反应。因其峰形尖锐，峰宽较窄，故而通常是测定其峰高来确定其发光强度；对发光时间较长的反应，其强度-时间关系如图1（B）、（C）所示。因其峰宽较大，拖尾较长，故而需要对(1-3)式的积分来求得其发光强度：
CL(t)dt=-фCL (1-7)
而浓度与强度的关系则如图2。
作为化学发光反应应具备以下条件[6]：
（1）化学反应必须能释放出足够的能量，以引起电子激发。通常是那些快速放热，且ΔH介乎-170到-300kJ/mol之间的反应，才能在可见光范围观察到化学发光现象。许多氧化还原反应所提供的能量与此相当，故而大多数的化学发光反应都是氧化还原反应；
（2）化学反应本身要有利于利用本身产生的能量用于不断产生激发态分子；
（3）激发态分子返回基态时，不是以热的形式，而是以光子的形式释放能量。
2．化学发光反应体系类型及其应用
有些具有共轭作用的体系有很好的发光效能。许多发光反应体系中的反应物也具有此结构特征。
2.1 酰肼类
在碱性条件下，酰肼类物质氧化产生N2与激发单重态（自旋量子不发生改变的称为单重态，改变了的则称为多重态）的[ArCOO-]*,[ArCOO-]*返回基态的同时辐射出光子。可表示如下：
ArCONHNH2 [ArCOO-]*+N2 (1-8)
[ArCOO-]* ArCOO¬¬¬-+hυ (1-9) 若分子中连有供电子基团（即邻对位定位基），则其发光效率将有所增加；Ar为稠环时发光效率较为单芳环时高；为氮杂环时又较为苯环时高。
在酰肼类化合物中，以鲁米诺luminol的发光效率为高，且检测限低，线性范围较宽 [7].
在鲁米诺参加的反应体系里，主要时过氧化氢充当氧化剂。然而一般情况下，二者的化学发光反应并不迅速，发光时间只有30秒左右，且强度不高。可一旦有某些催化剂参加，反应就非常迅速。Luminol-H2O2体系也是人们研究得最多，应用得最广的发光体系之一。
2.2吖啶类
吖啶类的典型代表是光泽精（Lucigenin），它本身即为荧光化合物1935年由 Glen 和Petsch发现[5，8] 。光泽精以硝酸盐的形式存在，在碱性介质中，过氧化氢将其氧化成四元环过氧化物中间体，而后列解生成激发态的吡啶酮而发光[2]。
光泽精的化学发光反应时间比鲁米诺发光反应持续时间长得多，同抗坏血酸反应，10秒后化学发光信号达到峰值[3]。
光泽精还可与还原剂作用。基于此，很多临床医学上重要的还原性物质得以测定。如抗坏血酸、谷广甘肽、乳糖、葡萄糖等。与这些还原剂反应化学发光信号需要几分钟达到峰值，并可稳定数分钟[9]。
另外， McCapra等合成了一系列吖啶酯类（Acridinium Ester），在碱性条件下为H2O2所氧化而发光。对该类试剂的化学发光机理研究表明，发光效率与试剂中的可离解酸性集基团的pKa值密切相关。pKa值一般小于11[2]. 此化合物曾用做DNA的发光探针。以化学发光法测定DNA,检出限可达2×10-18mol[10,11]。
2.3咪唑类
洛粉碱（Lophine,2,4,5-三苯基咪唑）是咪唑类的代表。虽早在1877年就发现了洛粉碱，使它成为文献上记载最早的化学发光试剂，却迟迟未得到应用。直至1979年Marino等人将它用于测定Co后才引起人们的注意。Lophine广泛应用于测定多种无机金属离子。其发光反应也是在碱性条件下被氧化而发光.[12]
2.4过氧草酸酯类
过氧草酸酯（peroxyoxalates）的化学发光反应涉及过氧化氢与芳基单酸酯（aryloxalate esters）之间的反应，是最有效的非生物发光反应，量子发光效率超过20%-30%[3]。较早提出的机理是基于化学发光激发荧光[13].
A+荧光剂分子（基态）→2CO2+荧光剂分子（激发态） (1-10)
荧光剂分子（激发态）→荧光剂分子（基态）+hν （1-11）
草酸酯与过氧化氢反应生成一种高能量、不稳定的双氧基化合物A，A的分解所释放出的能量为荧光剂分子吸收而引起发光。[14]
常用的草酸酯有双-（2，4，6-三氯苯）草酸酯（TCPO）和双-（2，4-二氮苯基）草酸酯（DNPO）。
过氧草酸酯作为化学发光试剂的优点式读pH允许范围宽。[3]TCPO最大化学发光强度在pH7.5，可在 pH5-9内使用；DNPO可在pH3.5下使用。其局限性在于须使用有机溶剂。
但是若此法与HPLC联用，检测下限可达10-15 mol/L, 有的甚至可达10-18mol/L[15]。
2.5其它化学发光反应体系
Luminol-H2O2,Lucigenin-H2O2是最常用的发光体系。基于此，许多氧化还原体系中加入能量接受体也会产生化学发光现象[2] 。如异烟肼-NBS体系[12]，Luminol-H2O2-亮绿Cu2+[16] ，Fe2+-H2O2-OP[17],Ce4+-抗坏血酸-罗丹明6G[18]。王伦等[18]通过实验，得出抗坏血酸线性范围为3.0×10-7-1.0×10-5mol/L，检出限为1.0×10-7mol/L。发光强度峰值出现在2秒到3秒之间，属于快速反应。方肇伦[3]介绍了三-（2，2’-联吡啶）钌（Ⅲ）{tris(2，2‘-bipyridine) - rutheninium(Ⅲ)} 体系。该体系涉及到电致发光，在水溶液中进行，pH4-8时发光强度稳定且无须除氧。吴风武等[98]提出了Ru(bipy)32+/Ru(phen)32+-C2O2-4-Ce(IV)化学发光体系反应动力学模型.Fatma A. Aly等[99]则基于tris(2,2/-bipyridyl)ruthenium(II)化学发光体系测定了氟灭酸. 韩鹤友等[100]以Ru(bipy)32+-KMnO4体系检测了肉桂酸．何治柯等[22,23]基于Ru-联吡啶- H2O2体系测定了药物中6-巯基嘌呤，Tween20作为增敏剂，检出限达3×10-10g/mol[21]。马容明等[22，23]基于Ru-邻菲罗啉-Ce4+-有机酸体系，建立了九种含有羟基或羰基有机酸的分析方法，提出了反应机理；基于Ru-联吡啶-Ce4+体系测定了巴比妥酸[24]、抗坏血酸[25]。柳仁明等[26]基于K2S2O8 在高温下氧化有机碳生成CO2，CO2又增强luminol- H2O2-Co2+发光体系建立了连续流动注射发光测定水中总有机碳的新方法，检出限为0.04μg /mL。
3.应用及发展
利用金属离子或有机物对化学发光体系的催化或是阻抑作用，可测定试样中的相应成分。贾生华等[19，20]利用Luminol-H2O2体系测定水中的As3+检出限达6×10-12g/mol, 线性范围为10-10-10-5g/mol，张海松等[22]以Luminol-H2O2体系测定水中的Cr3+,Cr6+，检出限为2.3×10-11 mol/L,线性范围为1×10-5-1×10-9mol/L.但是不同金属离子催化氧化发光试剂时，发光光谱雷同[1]。因而其选择性并不理想。通常从以下几方面解决此问题：
（1）选择适宜的信号，而滤去其它信号；
（2）预先对干扰离子进行掩蔽或时分离。常用的掩蔽剂是EDTA，常用的分离法是色谱法和萃取法；
（3）优化实验条件，试剂要有足够的纯度，水也通常要求用二次蒸馏水；
（4）加入敏化剂或是将样品溶液稀释。
对有机物的检测，抗坏血酸（ascorbic acid）是比较多的。如杨维平等[28]的流动注射化学发光抑制法测定抗坏血酸，检出限为4.0×10-8mol/L,线性范围为4.0×10-8-1.0×10-6mol/L，并绘制了动力学曲线。采用Luminol-K3Fe(CN)6体系。从曲线上看，发光强度峰值出现在30秒左右，发光时间持续68秒。另外，封满良等[29]早在1995年就利用FI-CL，采用Cu2+-Luminol体系测定抗坏血酸，检出限为6.2×10-7mol/L.线性范围为2.0×10-6-6.0×10-5mol/L，并证明了Cu2+的催化作用。1996年，同是封满良等[30]亦用FI-CL，采用Cu3+- Luminol体系，利用了多羟基结构有机物对该体系的正协同增强作用，得出检测限为1.5×10-8mol/L,线性范围为5×10-8-1×10-5mol/L.较以前有了显著提高。1996年，姚公安等[25]采用FI-CL测定了水中的苯甲醛含量，检出限为4.4×10-6mol/L，线性范围为2×10-5 -0.1 mol/L.着重讨论了介质及pH值对发光强度的影响。章竹君等[31]将乙酰胆碱酶和胆碱酶固定化，以FIA发光技术（luminol - H2O2-Co2+）测定了鼠脑组织中乙酰胆碱、胆碱。郑行望[36]等利用FIA,以Luminol- BrO- —OH-体系电化学发光测定了潘生丁，检测限达到0.004mg/L,线性范围为0.01-2mg/L;吴远远等[37]远以Luminol-Mn(II)-KIO4体系对尿酸进行了测定，检测限为1.8×10-9 g/mL,线性范围: 5.0×10-9 -8.0×10-6g/mL.李丽清等[38]以高锰酸钾-亚硫酸钠-核黄素体系,FIA法对核黄素进行了检测,检测限为3.0×10-8g/mL,线性范围:1.0×10-7-1.0×10-5g/mL.晨小霓等[39] 利用电解产生的高活性锰(III)氧化肾上腺色腙产生化学发光,以FIA手段检测肾上腺色腙,检测限为5.0×10-9g/mL,线性范围为1.0× 10-8 -1.0×10-5g/mL.聂峰等[40，41]以NaIO4- H3PO4 -H2O2-盐酸黄连素体系，对盐酸黄连素的检测限为：3.8×10-9g/mL,线性范围：1.0×10-8 -7.0×10-6 g/mL. 以NaIO4 - H3PO4-H2O2-盐酸土霉素体系对土霉素的检测限为4.3×10-9g/mL,线性范围为1.0×10-8 -6.0×10-6 g/mL.lifeng 李峰等[42，43]以Luminol-KIO4-H2O2体系测定了抗坏血酸，检测限为6.0×10-8mol/L,线性范围为1.0×10-7- 1.0×10-5mol/L.其11次平行测定的RSD为1.0%，值得一提。张小燕等[44]选择邻菲罗林银-Luminol -H2O2-Triton X-305体系，其化学发光强度较单独金属银产生的高5倍以上，检测限为：2.7×10-7g/l,线性范围：1.0×10-6-1.0×10-4g/l.，若以EDTA作为掩蔽剂，则将大大提高灵敏度和选择性。薛元英等[45]以高锰酸钾-已二醛-丙米嗪-H+体系，利用了已二醛对该化学发光的增强作用，测定丙米嗪的检测限为：1.2×10-8g/mL.线性范围：4.0×10-8- 1.0×10-6 g/mL.孙春燕等[46]则以KMnO4- H2SO4-甲醛-叶酸体系，检定叶酸，线性范围：1.0×10-7-1.0×10-5mol/L, 检测限：2.4×10-8 mol/L。该法用于片剂中叶酸的检测，结果与药典法一致。王志银等[47]采用NaIO4-H2O2-H¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬&no

本文引用地址：http://www.33ge.com/article/2007/0304/article_1305.html

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