分析化学论坛 » 【生化分析】 » western常用的步骤

judge0zz8 发表于 2008-1-2 18:30

western常用的步骤

[size=2]一、细胞裂解物的制备：dl(fo1_AW2A1i*Z/{
1．单去污剂裂解缓冲液：1%NP-40或Triton X-100 裂解缓冲液体系：2Zc(s%fQ(oy
NP-40 or Triton-100 1%Nl!S([0T+CsG7E
TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L
?f:YY0E)o NaCl 150mmol/LqA;_S6fu$p9hJb
PMSF（苯甲基磺酰氟） 0.1mmol/L(100µg/ml)
9v[],^|)LG0N Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 µmol/L(0.7µg/ml);qFf%ej%t ^DL
Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/ml"XMtLA$R%e
Aprotinin（抑蛋白酶肽） 0.3µmol/L(1µg/ml)
Z-Wk
e:]#ve （注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中；X+h
qEG
Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);
6W"r6CS4G
@ Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；
3zj`6\ \r6l Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存）
9V bVe!` 操作程序：
g(?2V/pE4B * 离心收集1×107 个细胞ptc!}|ZYE4uE
* 加入4℃预冷1%NP-40裂解液100µlH:](G,vt R C,x
* 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆） v Y3`+Qa w
* 4℃放置15~30min
#duRA%F} c3][6X2B * 4℃离心，15 000rpm,10min， 取上清备用。T_x%@e"_3`N(R3]
二、蛋白质浓度测定： sJVZJ sV
1.简单的：用280nm测吸光值，标准曲线$uP2wX1^2f+Z+p*a
2.精确的：用bio-rad 试剂盒，具体见附件
FUn0A\d
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
&g }t@.Y 样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有0.1％的SDS，样品和积层胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5％的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa。
Mfj2c6|l's;B （一）、材料：
XKb}{g&Iv)eG 1．30%（W/V）acry凝胶贮存液
@W$N}l 丙烯酰胺 29g， 亚甲双丙烯酰胺 1g 加ddH2O 溶至100ml,用新华滤纸过滤，棕色瓶中4℃保存，数月后重新配制。f ?9L[4u5WG
2. 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8 b,YH.S7Jpk
Tris base 18.15g
e5nQ1Qp ]+{ 加ddH2O 50ml,加浓盐酸至pH 8.8(约4ml),让溶液冷却至室温，再用ddH2O定容至100ml.
k,rMDh!K,K b 3. 1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8
] xWN5Gq%WW;e` Tris base 12.1gN2U2t}6u@s
加ddH2O 50ml,加浓盐酸至pH 6.8(约8ml),让溶液冷却至室温，再用ddH2O定容至100ml.
'VI~9\;C^S 4．0.5mol/L Tris-HCl, pH 6.8
v1{Puf Tris base 6.0g
JF2rD%^ Y~DbU 加60ml ddH2O,加浓盐酸至pH 6.8,定容至100ml'Rt(cQ3g_7a
5. 10% SDS :SDS10克，溶于ddH2O 100ml.%KC
nVp"w6~-n z
z
6.10% 过硫酸铵（APS）：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。过硫酸铵100mg，溶于ddH2O 1ml. 溶解后分装，-20度保存。
i9nYGbp-}/Zc 7.TEMED （四甲基乙二胺）TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合7V7u] ^1F/w\"_
8. Tris-甘氨酸电泳缓冲液, pH 8.3 （ 5×贮存液）： Tris base 15.1g
8GOn!K;C;D&V 甘氨酸 72g
}[#A+B O5C Y#B3}b 10%SDS 50ml （或SDS 5.0g）
_-vq+PFj` 加ddH2O至1000ml
I:B/X0I-@2X\Y 9.6×样品缓冲液100ml8P;z&fV(}U}({Q
0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8) 70ml(60mmol/L)\r6g0q]"XK
甘油 30ml(25%)
D-n2G4Lk/\ SDS 10gwTqNl0q,\
DTT 9.3g
If }u0ENd 溴酚蓝 12mgHSw_-E@.]#}
ddH2O 至100a4V7]E |"|?
4℃保存数周，或-20℃保存数月（DTT或者BME在用前加入） G9z7_#kT+q S
(二)、操作方法：
K"s)@?;b 1．将玻璃板洗干净，固定于电泳槽上；9t7_;P0A*bQT },c
2．按实验要求配制不同浓度的分离胶，加入TEMED后迅速灌胶，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加1cm），上部用水或30%乙醇封面（或0.1%SDS(丙烯酰胺浓度≤8%)或异丁醇（丙烯酰胺浓度≥10%））。Y't$Vq-zN9k*J6A
3．配制浓缩胶：按实验要求配制不同浓度的分离胶，一次性使用塑料管中配制合适体积与浓度的浓缩胶，加入TEMED后应快速旋转混合，迅速灌入浓缩胶。
5E6g4U|cj:mDteN 4．灌注浓缩胶：待分离胶完全聚合后（约30min）,倾出覆盖层液，用ddH2O洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的丙烯酰胺，再用滤纸小条吸净残留的液体，配制好浓缩胶后迅速灌入，并立即在浓缩胶液中插入干净的梳子,再加入浓缩胶溶液，以充满梳子间的空隙梳子用前用水清洗干净，临用前用乙醇擦拭，挥发至干），确保无气泡；待凝胶完全聚合后（30min）,小心取出梳子，清洗加样槽，将凝胶放入电泳槽内；将电泳缓冲液加入内外电脉槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中，排除加样孔内可能的空泡。;W^T_
u;H
5．样品处理：将蛋白质样品与6×SDS样品处理液（25μl+5μl），在一个子EP管中混合，100℃加热10min，冰浴冷却，离心1s,加样；
7`PK2BC8S1Q 6．加样：用微量加样器将蛋白质样品（总体积在40μl内，按照测得蛋白的量，算得相对加入的体积数）加入样品孔的底部，随染料水平升高而升高注射器针头。每孔上样的最大蛋白量：20~40µg。为了避免边缘效应，在未加样孔中加入等量的样品缓冲液. 须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。D t7dL&VuA
7．电泳：将电极插头与适当的电极相连，电流应流向阳极；将电压调至80V，跑完浓缩胶后，将电压升高到100－120V，染料的前沿迁移至凝胶的底部,关闭电源，拔掉电极插头，从电泳槽中取出凝胶玻璃板，小心移动两玻璃板间的隔片，将其插入两块玻璃板的一角，轻轻撬开玻璃板，凝胶贴于其中的一块上，于最左边一孔凝胶下部切去一角以标示凝胶的方向，用于印迹分析，则不切角。
4p4Q.iD6GrZB7G 8．染色：考马斯亮蓝染色0E![#Wx3O
考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝R-250 1.g 甲醇 450ml ddH2O 450ml 冰醋酸 100ml 过滤，常温保存；-ShXC k)Z1B{
考马斯亮蓝脱色液： 甲醇 45ml 冰醋酸 10ml ddH2O 45ml.~1gZ\M'\2eN"u9?
将凝胶置于染色液中（至少5倍体积的染液浸泡凝胶），放于摇床平台上，室温染色4小时以上，移出凝胶并回收染液，再将凝胶浸泡于脱色液中，仍置于摇床平台上，脱色4~8小时，其间换脱色液3~4次（脱色容器中放一小块海绵以吸附洗脱下来的染料。）
[;C;Zk0t'J_z!A^T 四、蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体0s#iSC9Z;d]7_
(一)、仪器电转移装置：NC，PVDF膜、Whatman３MM滤纸、摇床等
!J8s.Y+z1s$O （二）、电转移缓冲液：甘氨酸2.9g Tris 碱 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml "O }zh0XR
加ddH2O至1000ml
f:w-SQ~$x b （三）、操作步聚：（湿转：相同-70V，2h，14V）J`|$G
O0@
1．ddH2O清洗电极板，吸水纸揩干液滴；
zMC+j D-s'`r 2．戴手套，切6张滤纸与1张PVDF膜，与凝胶大小一致，并标记；
/~!t8M5]
U g 3．PVDF膜先泡于100%甲醇，ddH2O漂洗５min,浸入电转移液中，注意驱除滤膜上的气泡；[PWP dWj @U}!{
4．在一浅托盘中加入少量的电转移液，把６张３MM浸泡于其中；
-b|5zt)e!J8EO 5．安装转移装置：Lyvz'x`(\e/\0{o
a．平放底部电极（阳极），石墨一边朝上；*F$mQF6R,w2|
b．在这一电极上放置３张用转移液浸泡过的３MM滤纸，叠放对齐，然后用 玻璃移液管作滚筒，挤出滤纸间的所有气泡；8XY7x Z z%v`(VuD
c．PVDF膜放置于滤纸上，精确对齐，并排出气泡；
n^
F p*Lt mu6X7y d．从电泳槽上撤出放置凝胶的玻璃，把凝胶转移至一盘去离子水中略为漂洗，然后准确平放于PVDF膜上，把凝前的左下角置于膜的标记角上，排除气泡；
+xz&dU-j,AP e．把后３张滤纸放置在凝胶上方，同样确保各层精确对齐，不留气泡。
n ar8RX3I6@M ６．将靠上方的电极（阴极）放于平层物上，石墨一边朝下，连接电源，根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通电流，电转移１小时左右；半干转是0.03A(电压可从4伏上到12伏左右)2dy4E3w _r
L7G}
７．断开电源，拆除转移装置，去除各层，把凝胶转移至至盛有考马斯亮蓝的染液托盘中进行染色，以检查蛋白质转移是否完全，将PVDF膜浸泡于去离子水中，驱除气泡，然后用丽春红Ｓ进行染色。!q*] q)W9f-a
五、对固定于PVDF膜上的蛋白质进行染色
Z]g$u6x/s ZiQR 采用丽春红Ｓ染色法：丽春红S染色法可与所有免疫学检测方法兼容，这是因为该染料只会短暂显色而且在进行Western印迹时可被洗去。因此，丽春红S染色并不影响随后用于检测抗原的显色反应，这些显色反应是由已偶联抗体的碱性磷酸酶或乳过氧化物酶等催化的。然而，由于其显示的紫红色不容易拍摄下来，这种染色不能提供永久性实验记录
Mfl;DR 　１．10x丽春红Ｓ贮存液：丽春红Ｓ２g,　三氯乙酸30g, 磺基水杨酸30g，加水至100ml
O0d%e}t!jw 　２．方法：
7xL^:z;KX+_jL ] a.把滤膜放入含有丽春红Ｓ使用液的托盘中染色5~10min,轻摇，-g6FGmL!_2]CD
b.蛋白带出现后，于室温用ddH2O漂洗，期间换水数次；9H0[bG c|,y&yj8t
六、封闭非特异性结合位点　r
K0i*g:N
　将膜放入可加热封接的塑料袋中，根据膜面积，以0.1ml/cm2的量加入封闭液（5%脱脂奶粉，0.1%Ｔween 20于PBS或TBS），尽可能排除气泡，密封，平放于摇床平台上，室温温育１～２小时。
q7s4qL#{w'X x/W9O 七、一抗
NSs6C4rz8ojL)ec 取出膜在PBST中洗涤5minX3次；将膜放入可加热封接的塑料袋中，加入合适浓度的一抗，室温温育2小时或37 C 1小时3cO0|o [
八、二抗
l:yI5{ m8w.rJc9W 取出膜在PBST中洗涤15minX3次；将膜放入可加热封接的塑料袋中，加入合适浓度的二抗，室温温育1小时或37 C 0.5小时，xG0x5B#}w!k+W6\D
九、ECL发光检测|'i/\A!O8[tH6iHo
取出膜在PBST中洗涤5minX3次；用平整的吸水纸轻轻吸去膜表面水分，将膜浸入ECL反应液中（A和B液等体积混合后立即使用），室温1min^,t\'p;~w
十、暗室
y7ool|Q 吸去液体，用食品保鲜膜覆盖，在暗室用X线片曝光，显影、定影后观察结果。　最后压片时可以多压一会，半小时差不多，背景的情况下，你可以多压几张片子，很多情况都是因为背景太黑，光看见膜，看不见带，，连续压几张，膜的背景就减轻了
8?m6h&aV{/_-E [/size]I+Koj;Qc
[size=2][/size]
KM'E/AO [size=2][/size] "`_.o/g&m,u&S
[size=2][/size]
;RA2kF2C%C K YjJ [size=2]谢谢 [b][color=#000066]小鱼儿218  大哥[/color][/b]
Q%n/DR\*sID8{ [/size]

深水 发表于 2008-1-16 21:43

仔细读了下。

深水 发表于 2008-3-10 18:32

:victory:

查看完整版本: western常用的步骤