微流控芯片中的固相萃取技术
[font=黑体][size=12pt]1 [/size][/font][font=黑体][size=12pt]引言[/size][/font][font=宋体]近几十年，微全分析系统（[/font][font=Times New Roman]μTAS[/font][font=宋体]，又称芯片实验室，[/font][font=Times New Roman]lab on a chip[/font][font=宋体]）在化学和生物应用中复杂样品的传输、分离和检测上的发展上面引起了极大的关注[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman]μTAS[/font][font=宋体]或者芯片实验室中一个主要的挑战就是样品的预处理，因为天然产物中含有很多不同的组分和杂质。[/font]Uq"Je$p3b
[font=宋体]目前大部分预处理过程都是在微芯片外实现的，这必然会造成样品的损失与污染，同时不利于[/font][font=Times New Roman]μTAS[/font][font=宋体]的集成化。因此，样品预处理技术的研究是目前微流控分析系统研究中最为活跃的领域之一，蕴含了许多新技术的生长点。[/font]
[font=宋体]在众多的样品预处理技术中，固相萃取显示出了卓越的性能。固相萃取（[/font][font=Times New Roman]solid phase extraction, SPE[/font][font=宋体]）常被用于试样的预分离富集，以降低检测限或克服干扰。它利用选择性吸附洗脱的分离原理达到快速分离、净化与浓缩的目的，常应用在[/font][font=Times New Roman]GC/MS[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]LC/MS[/font][font=宋体]分析前的试样去盐和预浓集处理。与其他相比具有很多的优势：（[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]）可以利用填充物和洗脱剂的不同，选择性地浓缩特定的分析物，具有更好的选择性；（[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]）在吸着柱未突破前，预浓缩的量仅受浓集时间的影响，因此常可达较高的浓集倍率；（[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]）无需准确控制缓冲液的浓度。[/font]suh9_*T,e-LX q
[font=黑体][size=12pt]2 [/size][/font][font=黑体][size=12pt]固相萃取柱的种类[/size][/font]
[font=Times New Roman]1998[/font][font=宋体]年，[/font][font=Times New Roman]Figeys[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]在芯片外接一内充[/font][font=Times New Roman]C18[/font][font=宋体]硅胶的毛细管作为固相萃取微柱，首次实现固相萃取与[/font][font=Times New Roman]μTAS[/font][font=宋体]相结合，利用质谱分析法进行蛋白质分析，检测限达[/font][font=Times New Roman]amol/μL[/font][font=宋体]。但由于必须用一定长度和内径的管道连接，势必产生一定的死体积。最近，[/font][font=Times New Roman]Oleschuk[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]通过微加工技术，在芯片通道中加工形成一微腔，用以填充填料，直接将固相萃取微柱集成在芯片内，这样可消除连接用的死体积，提高浓集倍率。按照吸着剂存在形式不同，[/font][font=Times New Roman]SPE[/font][font=宋体]可以分为开口柱管、填充剂和整体柱三种类型。[/font]
[font=黑体]2.1 [/font][font=黑体]开口管柱[/font]
[font=宋体]开口管柱的制备相对简单，因此是一种较常用的固相萃取柱。在芯片通道内壁涂渍或键合具有高度亲和性的固定相制成的[/font][font=Times New Roman]SPE[/font][font=宋体]柱称开口管，涂层与目标分析物之间能相互发生作用，不需要的化合物和基质则流出成为废液。缺点是涂层的有效表面积很小，制约了固相萃取柱的容量。[/font]
[font=宋体]涂渍法是一种简单的基于物理吸附的开口管柱制备方法，只需要将涂渍试剂加入微通道中即可。[/font][font=Times New Roman]Kutter[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]在玻璃芯片通道内涂渍[/font][font=Times New Roman]C18[/font][font=宋体]固定相，用于富集中性的香豆精[/font][font=Times New Roman]C460[/font][font=宋体]染料。经过了[/font][font=Times New Roman]160 s[/font][font=宋体]的富集和洗脱，香豆精染料浓度增加了[/font][font=Times New Roman]80[/font][font=宋体]倍。而[/font][font=Times New Roman]Broyles[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]将固相萃取预浓集与电色谱分离分析相结合，在管道内壁涂渍的[/font][font=Times New Roman]C18[/font][font=宋体]既是固相萃取的吸着剂，同时也是电色谱分离的固定相，得到了很好的富集效果。[/font]8{[*s&K H;J9~0A
[font=宋体]尽管涂渍制备比较简单，但涂层会随时间而消耗，厚度变得不均匀，稳定性变差，使其应用受到了一定的限制。因此，基于玻璃、硅以及有机聚合物等表面键合的方法得到了发展。其中作为表面键合的基质，玻璃或硅材料制成的芯片应用最广泛，其表面通过酸或碱处理后可产生较多的可与硅烷化试剂反应的硅羟基；另外，有机聚合物微流控芯片由于加工制作过程简单、成本较低，有望实现批量生产[/font][font=宋体]，而成为目前研究的热点。[/font]
[font=Times New Roman]Henry[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]利用氨解作用在[/font][font=Times New Roman]PMMA[/font][font=宋体]表面键合上氨基功能团，通过烷烃桥联作用，能进一步吸附含氨基的化合物。最终获得末端键合有氨基的[/font][font=Times New Roman]PMMA[/font][font=宋体]芯片，有效地实现了对[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]限制性酶的固定，从而限制了[/font][font=Times New Roman]dsDNA[/font][font=宋体]的吸附。氨基修饰的[/font][font=Times New Roman]PMMA[/font][font=宋体]芯片可进一步与各种试剂反应，提供带有不同官能团的[/font][font=Times New Roman]PMMA[/font][font=宋体]表面，以对不同目标物质进行分离。[/font]
[font=宋体]开口管柱的吸附容量受到通道比表面积的限制，较厚的液膜会增大传质阻力。因此，发展新型的吸附材料以及修饰技术，合理地选择芯片材料和设计微通道成为提高固定相分离富集效率的需要。[/font]#e z$Xq'n#bI
[font=黑体]2.2 [/font][font=黑体]填充柱[/font]
[font=宋体]在芯片通道中的某一段填充固相材料（通常为[/font][font=Times New Roman]C18[/font][font=宋体]），制成的固相萃取柱成为填充柱。填充柱对试样中目标化合物的吸附表现为物理吸附和化学吸附两种形式。物理吸附主要指利用填充微粒对试样中不同粒径组分的拦截作用，选择性地让一部分组分通过而截留另一部分组分，达到分离纯化的目的；化学吸附指对填充微粒表面进行化学修饰后，使其具有选择性吸附某类物质的能力，而实现分离富集。与开口管相比，填充柱的表面积大，固相萃取的容量亦得到了提高。[/font]
[font=宋体]进行填充柱固相萃取的关键是制作微型填充柱，拦击住固相颗粒，是其仅聚集在芯片通道内的一定位置。操作过程主要有：（[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]）通过微加工技术直接在芯片通道中形成围堰、栅栏、坝等微结构作为固定相填充床；（[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]）将硅胶、微珠等颗粒通过电驱动或压力驱动引入填充床作为固相萃取吸附剂；（[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]）对试样中目标物进行分离富集。与开管式固相萃取相比，填充式固相萃取能获得更大的比表面积，有利于提高对目标物的分离富集效率。[/font]lZ"r8G o
[font=Times New Roman]Oleschuk[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]采用围堰式填充柱进行固相萃取分离，以[/font][font=Times New Roman]Spherisob ODS1[/font][font=宋体]作为吸附剂，富集荧光试剂[/font][font=Times New Roman]BODIPY[/font][font=宋体]。整个富集过程包括四步：用缓冲液对固相萃取柱进行平衡；试样引入、待测物被吸着；缓冲液冲洗；待测物洗脱。使用该装置，消除了死体积，不存在由于离线富集而引起的样品损失与污染的现象，极大地提高了富集效率。该小组[/font][font=宋体]在随后的研究中，发展了双围堰填充床的制备技术，获得稳定性更好、使用寿命更长、富集效率更高的吸附剂，并在[/font][font=Times New Roman]CEC[/font][font=宋体]模式下对氨基酸样品进行了定量分析。[/font][font=Times New Roman]Ceriotti[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]在[/font][font=Times New Roman]PDMS[/font][font=宋体]芯片上设计了一个双[/font][font=Times New Roman]T[/font][font=宋体]通道和一个与之相通的锥形通道，将[/font][font=Times New Roman]3 μm[/font][font=宋体]的十八烷基硅胶微粒引入到锥形通道内，通过“楔石效应”使其形成填充柱吸附剂，在电泳模式下，以[/font][font=Times New Roman]FITC[/font][font=宋体]标记的氨基酸作为样品对象，对该吸附剂的稳定性及吸附性能进行评价，效果良好。[/font]
[font=宋体]在微流控芯片系统中进行非均相免疫分析是一种非常重要的分析方法。而通过在微珠表面固定抗体，再将其填充到芯片的通道中，对抗原进行吸附富集，是一种重要的样品分离富集方法。常用的微珠有聚苯乙烯微珠、琼脂凝胶微珠及磁性微珠等。[/font][font=Times New Roman]Sato[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]先后将抗体固定在聚苯乙烯微珠上，然后填充在具有堤坝结构的通道中，使微珠保持在通道中，作为抗原的吸附剂，进行免疫反应，该方法获得了极低的检测限。[/font][font=Times New Roman]Choi[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]通过磁场将表面固定有生物素标记抗体的磁珠固定在芯片通道中，通过控制磁场，可以方便地引入或排出磁珠，操作简单。另外，多孔硅由于具有高的比表面积、优异可控制的孔性能、非特异性吸附少、稳定性好等优点，目前在微流控芯片系统非均相免疫分析中也被广泛地用作蛋白质或[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]等生物分子的固定载体[/font][font=宋体]。[/font] l [6ON-]6Q\ x
[font=宋体]填充式固相萃取吸附剂能提供较大的比表面积，可获得较大的吸附容量，但吸附剂需要保持在微坝或其它特殊结构中，因此多数填充过程相对复杂，且对微芯片加工技术也提出了更高的要求。[/font] `&l m|'GdC`il
[font=黑体]2.3 [/font][font=黑体]整体柱[/font] I;s*z4KI`
[font=宋体]整体柱材料是上世纪[/font][font=Times New Roman]80[/font][font=宋体]年代后期发展起来的一种新型材料，通常是通过反应试剂原位聚合而得到的棒状整体[/font][font=宋体]。整体柱具有双连续结构和双孔分布两大特点。双连续结构由相互交联的基质骨架和彼此连通的穿透孔组成；双孔分布是指整体柱中存在两种类型、不同大小的孔，一种是微米级的穿透孔，另一种是位于骨架表面的纳米级骨架孔。与传统的多孔微球型柱材料相比，穿透孔的存在使得整体柱材料具有较好的渗透性和较小的传质阻力。[/font]J1S H2MP7u4l4m
[font=Times New Roman]1998[/font][font=宋体]年，美国加州大学伯克利分校的[/font][font=Times New Roman]Frehet[/font][font=宋体]研究组[/font][font=宋体]首次将聚合物整体柱用于固相萃取。他们以热引发的方式在[/font][font=Times New Roman]PEEK[/font][font=宋体]管内合成了聚苯乙烯整体柱材料，并通过调整预聚合溶液的比例，增大了该整体柱的比表面积和孔径，提高了萃取容量。他们还加入了另一种共聚单体[/font][font=Times New Roman]2-[/font][font=宋体]羟基甲基丙烯酸乙酯以增加整体柱材料表面的亲水性，并比较了加入前后整体柱材料对酚类物质的萃取性能。实验证明亲水性单体的加入改善了整体柱表面与样品溶液的浸润，提高了对极性物质的萃取回收率。[/font]9e.N u"ng qq F)G
[font=宋体]近年来，整体柱作为一种新型的样品预处理材料，已经引起了越来越多的分析化学家的关注。目前报道的整体柱作为微流控芯片系统中的固相萃取吸附剂，主要有芯片上整体柱和芯片外联整体柱两种存在形式。[/font][font=Times New Roman]Yu[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]采用光诱导在芯片通道内原位聚合反应形成了多孔聚合物整体柱，用于芯片中固相萃取试样预富集。通过改变单体溶液的配比和组成，分别基于甲基丙烯酸酯类的疏水型和离子交换型聚合物，制备了表面性质、孔径大小、空隙率等不同的整体柱。并用制得的整体柱对香豆精[/font][font=Times New Roman]519[/font][font=宋体]，香豆精[/font][font=Times New Roman]5192[/font][font=宋体]肽化合物、绿色荧光蛋白质等分子量不同的化合物进行富集，获得[/font][font=Times New Roman]103[/font][font=宋体]以上的富集倍数。[/font]
[font=宋体]芯片外联式整体柱可以通过热引发有机单体原位聚合反应来制备[/font][font=宋体]；另外，对制备过程要求严格的无机硅胶整体柱与芯片的连接也可以考虑外联方式。在这种外联方式下，只需选择合适的接口方式，即可实现整体柱与芯片的连接。该方法具有较好的灵活性，可方便地更换固相吸附剂而不影响芯片其它单元的操作。由于有接口的存在，易产生死体积，降低分析效率，因此，合理的接口设计是芯片外联式整体柱实现有效分离富集应考虑的重要因素。[/font]A8g&^G@'t#q
[font=宋体]微流控芯片系统的目标是对样品进行快速、准确和高通量分析。然而，现实样品成分复杂，针对样品每一种成分，预处理的要求是有差别的。整体柱吸附剂制备过程简单、聚合过程容易控制、可获得不同性质的化学表面。因此，在芯片上集成阵列式整体柱吸附剂，不仅增大了样品吸附容量，还能够有效分离富集得到目标物质，是一种有效可行的方法。[/font][font=Times New Roman]Tan[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]在带有[/font][font=Times New Roman]8[/font][font=宋体]个平行通道[/font][font=Times New Roman](10 mm[/font][font=宋体]长，[/font][font=Times New Roman]360 μm i.d.)[/font][font=宋体]的有机聚合物芯片上的微通道内，利用紫外引发单体溶液发生原位聚合反应制备整体柱，从而获得了具有分离富集能力的八阵列式微整体柱芯片。进一步实现了人尿样品及[/font][font=Times New Roman]P450[/font][font=宋体]药物的固相萃取分析。在使用过程中，未发现整体柱收缩以及整体柱和芯片之间开裂的现象。[/font]
[font=黑体][size=12pt]3 [/size][/font][font=黑体][size=12pt]填充物和洗脱剂[/size][/font]
[font=宋体]根据吸着机制不同，固相萃取吸着剂可分为离子交换与分子吸附剂，前者主要用于金属离子的预浓集。固相萃取中所用的填充剂不同于色谱中所用的填充剂，其目的是为了在柱上分离多种组分使其各自达到检测限。因此，固相萃取填充柱一般较短，填充物颗粒较大。[/font]
[font=宋体]在集成的微流控分析中，为达到较高富集效率和分析速度，对洗脱剂的要求主要有以下几点：[/font]rj5d r!r!u k8g M
[font=Times New Roman]a．
[/font][font=宋体]能迅速从吸着剂中解吸待测组分；[/font]B?[K e!z ~
[font=Times New Roman]b．
[/font][font=宋体]能产生电渗流；[/font]
[font=Times New Roman]c．
[/font][font=宋体]采用光学检测时，应使洗脱剂尽可能与先导溶液介质的折射率相近。[/font]G,b9O8L0}9mTh
[font=黑体][size=12pt]4 [/size][/font][font=黑体][size=12pt]影响富集倍率的因素[/size][/font]u E?A!QT-eo n
[font=宋体]富集倍率可表示为[/font]"C u-|o(A-x9w
[align=center][align=center][font=Times New Roman]EF = p(Vi/VF)[/font][/align][/align][font=宋体]式中，[/font][font=Times New Roman]p[/font][font=宋体]为相转移率；[/font][font=Times New Roman]Vi[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]VF[/font][font=宋体]分别为试样溶液体积和洗脱液体积。[/font]\C/W+T7sJ1]*hu
[font=宋体]从上式可以看出，影响富集率的因素主要有：[/font] T(w?&F5rq
[font=Times New Roman]1.
[/font][font=宋体]装样时间和装样速度。随着装样时间增加试样量增大，富集率提高。[/font]6M-^#t,Wa6hh x
[font=Times New Roman]2.tsn wtqr!C
[/font][font=宋体]洗脱时间和洗脱液流速。为达到较高的富集效率，应选用强洗脱剂进行快速洗脱，减少洗脱时所用洗脱剂体积。[/font]
[font=黑体][size=12pt]5 [/size][/font][font=黑体][size=12pt]总结[/size][/font]i+P|S Y
[font=宋体]固相萃取技术处理介质和操作方式灵活多变，作为微流控芯片中一种重要的样品与处理技术已有不少研究和应用，显示了巨大的样品在线预处理潜力。但是，目前微型驱动和微型接口技术的研究和发展尚不成熟，还有待进一步改进及完善，集成化的在线无损操作也是实现高效联用的目标。[/font]
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