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深水 发表于 2003-6-28 19:55

关于HPLC的常见问题及解答

   一、问:用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？ nPGwF(hE
            答:关于漂移问题：|i5p*sb;T/RF
            1． 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定]1RK*O2F7k4Qw
            2． 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等'jF Kh*LL0?
            3． 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡
/K-nt4y!s.s2l%E             关于快速变化问题9|)A^,@`KB[
            1． 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
3dnM6NV3Y
M U:k             2． 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
7]e1n kU*aG             3． 流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
1|Av[c`l:H%Dd0fs             
|c)n*A6bI;L7E4_             二、问:液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？-j5?N:XZby7m"DF
            答: 1． 筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。5s t:Sx,cV%N
            2． 存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子^Bm t e
             XMHe,DO
            三、问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法,PxPF,Q@3Z7l
            答: 1． 样品量不足，解决办法为增加样品量
7fvt)e.\nGN             2． 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
7K|_eHv             3． 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器#Z#xm'w*sr
            4． 检测器衰减太多。调整衰减即可。:^i'lM4T l$p,D%Az2ml
            5． 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数
ZR])tGfFq ]s             6． 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。$F;|@g| tU
            7． 检测池中有气泡。解决办法为排气。bdLSeLt
            8． 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。
2eR%]SE
B             9． 流动相流量不合适。调整流速即可。5s1paP(t.IE
            10． 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
/^%zE}U.a#@              |T"yI?-h0@l#s ^
            四、问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？Y#e6S,vhm
            答：原因可能有：
1u%TzT'g+I$Mp2HY             1． 泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
7G6B8O2um/c             2． 比例阀失效，更换比例阀即可；)g!Tu-?@*zz
            3． 泵密封垫损坏，更换密封垫即可；O5^+K2}\
            4． 溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；0c8\8k
}8? v
m
            5． 系统检漏，找出漏点，密封即可；1[+qT&s
P Dlu1t&k-f
            6． 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。L3J(l#C z"uR d0o
             E.GA8t[ S
            五、问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？
3Jk[5i|,u             答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
HW |5m k!m&C+m B             1． 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；
6A a ~j^ S'a2O RJ             2． 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；
'{BfY cc]&S             3． ,?pqQ0A
            将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；
3yq6A%~:g2~0QRsX             4． 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。 y,yfwc se
            一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne .Z7R$F6|8Gat$Y/EZ
            7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

杰林 发表于 2003-8-24 17:01

关于HPLC的常见问题及解答

很实用

eddie 发表于 2004-1-29 17:40

关于HPLC的常见问题及解答

很棒的主题帖,支持一下!!

biomiao 发表于 2004-3-6 11:34

关于HPLC的常见问题及解答

我在使用液相色谱检测蛋白质的时候选择了两个波长分别是254nm和280nm,结果其中的一个峰在254nm下有光吸收而在280nm下没有光吸收，为什么会出现这样的问题？可能是很弱的问题，请大家帮帮忙……

杰林 发表于 2004-3-6 21:17

关于HPLC的常见问题及解答

我没有测过蛋白质，在不在这两个波长下出峰，要看被测物的吸收光谱是不是在这两个波长下都有较强的吸收，不知道你所测的蛋白质是不是这样，如果已知在这两个波长下都出峰，而且其它峰都正常，说明仪器没有问题，可能你这里出现的这个峰是其它杂质，而不是你要测的蛋白质。仅供参考。

biomiao 发表于 2004-3-8 11:42

关于HPLC的常见问题及解答

谢谢斑竹的解答，具体一些的情况是这样的：我是在完全相同的流动相条件下，同时测定了280nm和254nm两个波长的光吸收，一共是两个样品，第一个样品是通过凝胶过滤纯化的蛋白质样品跑HPLC，第二个样品是将前面纯化的蛋白用还原剂巯基乙醇处理以后再跑HPLC，实验结果是处理以前的样品在两个波长下峰形几乎一致，但是对于处理以后的样品，254nm下是3.707出了一个比较明显的峰，而280nm下则出现了3.169、3.690、4.135和4.236四个非常不明显的峰。其他各时间的出峰时间都是一致的只有这个区域的发生了这样的情况。有没有可能254nm下巯基乙醇有明显的光吸收？或者3.707和3.690的两个峰实际上是一种物质？还要请大家帮帮忙……实验结果令人很郁闷……ZV3Y U{d
JM

biomiao 发表于 2004-3-8 11:46

关于HPLC的常见问题及解答

还有，有没有可能有的蛋白质在254nm下有光吸收，而在280nm下几乎没有光吸收？

213 发表于 2004-3-8 13:47

关于HPLC的常见问题及解答

有啊，蛋白质的吸收取决于官能团，有的蛋白质只有在一个区域有吸收峰，苯环

杰林 发表于 2004-3-8 14:33

关于HPLC的常见问题及解答

3.707和3.690从保留时间上差异很小，完全可能是一种物质。另外，关键是第一个样品和第二个样品相比，出峰有多大变化，所列的四个峰，在第一个样品中也有吗？消失了的是被还原掉的，增加的可能就是巯基乙醇带进去的。

杰林 发表于 2004-3-8 14:35

关于HPLC的常见问题及解答

还有你可以找个DAD检测器看一下每个峰时刻的光谱图就清楚了，如果实在找不到就把样品寄给我。

biomiao 发表于 2004-3-9 09:46

关于HPLC的常见问题及解答

谢谢大家
?In6jD&o2zq zn 因为没有办法在这里上传图片，所以把图片上传到了下面的这个网址，请大家帮帮忙分析一下，能不能就根据254nm下的图谱就说，该物质经过还原处理，由处理以前的一个峰变成了处理以后的两个峰，可是280nm下的图谱又该怎么解释呢？UM
p,K/};KL#J)X
斑竹指的DAD检测器检测能不能直接利用HPLC上的DAD检测呢，谢谢斑竹。

biomiao 发表于 2004-3-9 09:59

关于HPLC的常见问题及解答

http://cn.f1.pg.briefcase.yahoo.com/biomiaoer

biomiao 发表于 2004-3-10 08:26

关于HPLC的常见问题及解答

[这个贴子最后由biomiao在 2004/03/10 08:57am 第 1 次编辑]ex0rx T)D

+Sum^%?wt

杰林 发表于 2004-3-12 11:39

关于HPLC的常见问题及解答

怎么你的文件夹是空的？
Tu/_%}O1D4Y 就是HPLC带的DAD检测器

qiu_429 发表于 2007-5-13 16:52

基线不稳 怎么回师

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