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深水 发表于 2006-4-16 00:28

电喷雾质谱新方法及在生命分析化学中的应用

　生命分析化学是一门新的交叉学科,它的着重W0lfG"wwq
点是在于为生命科学研究提供高效、快速、简便、准
F,c3SOEx&r']h 确的分析手段,综合运用来解决生命科学中的重大"U7cH'\3P9|.k;H
问题1 。生命分析化学所面临的分析对象都是生物\5jdF(v~0z
c`9[l.j&F
样品,如组织提取液、血液、尿液等等,如何在复杂的J#T&t2b
Sy@
基质中高灵敏度、高选择性、高准确性地分析待测组,gj9AGeX2\(X
分,是生命分析化学需要解决的关键技术问题。生
3N0^7A"NB3d$D5uw 物质谱及其与色谱联用方法被认为是当今最强大的
Z6W|Z+n3J8p+h 混合物分析技术之一,在生命分析化学中有着广泛T,[Ga!DJ@:^p
的应用。生物质谱技术的发展得益于电喷雾离子化
1pa#dd1u.JEd-P (ESI) 和基质辅助激光解析离子化(MALDI) 技术的x(q#oUp
发展,MALDI 技术主要应用于蛋白质等生物大分子
F^$B3x2q9U_Z 的分析, ESI 技术既可应用于大分子分析也可应用,kjm {
Wxy
于小分子分析,目前ESI 是色谱质谱联用最常用的
M&}4`R
@ 离子化方式。本文介绍几种电喷雾质谱新方法及其 QEe;Zz+|L,E
应用实例,为生物质谱技术的新方法开发和应用提c'\!b\2[Tz
供参考。
px%Z.??$] a+vmM 1 　能量梯度扫描中性丢失串联质谱法(EG2

lc3s-E|Z6[ NLS) 2
I m1h\uDr4h/c$S^K 　　在生命分析领域经常希望对未知样品中的某一
Fhv8I
y/fgb7[ w@ 类化合物进行快速全面的筛查,例如考察样品中含
HRNX!skK(P 某一类成分的情况或者某一类疾病的筛查。EGNLS
mO*rYW)HbS9w#i 法为解决这一问题提供一种创新的方法。该方法的
,P\[
T5S-E p2~[ 建立首先基于CAD 下质谱反应最佳碰撞能量
y-O.]?5g ux1C6U (OCE) 的稳定性,并发现OCE 数值与化合物结构的
AGE'{ UL {)U3B 相关性。通过研究17 种代表性苷类(黄酮类、蒽醌Np6?:Zv4xk?
类、萜类和其它杂类如芪类等母核所形成的苷类) 的 k!@jl+U4Ptx[l_
CAD 行为,发现不同结构的苷类表现出特异而稳定
uMG p.q 的OCE 数值,例如非芳香性的苷类OCE 一般在55 )@Q)|H9~ R,`F
～65eV 而芳香性的苷类OCE 一般在19～30eV ,较
tO/c XEm$N,iF#K 小的非芳香性的苷类的OCE 往往比较大的芳香性.H}-h n{'MD
苷类更高(见图1) 。这一实验结果显示化合物的结
(wV Rw+m;Z1[4W 构是决定OCE 的主要因素并且OCE 对化合物结构&Zx1t+Q|!b-X
具有特异性。因此,EGNLS 方法可以用来区分芳香
o"O ?'g4Qm2b.Qy 性和非芳香性的苷类。而且,实验发现,每个离子的{el!REYG
强度2能量离子流图峰宽、峰形相当重现,这也可能
Y"StSet.Z)zA 作为另一个定性的指标。另外,在CAD 能量25eV
x J@v4K-\([F'd 下,大部分非芳香性苷类均不可见,而在60eV 下,大0_M6Z-Q#`r
部分芳香性苷类也不可见。因此,若使用普通的固6@H?8w)|x3m7{+Q
定能量中性丢失扫描分析这个混合物,很容易丢失
U/_5g#K5XiR%o h(u 重要的化合物。,CB'I9\"_ u
图1 　17 种代表性的一次扫描的EGNLS 图(丢失162) U:Wur0xp`
A. 总离子流图;B. 栀子苷的提取离子流强度2能量图;C. 人参
,C:Fpg
~v6I sk0O 皂苷Rg3 的提取离子流强度2能量图;D. 在CAD 碰撞能量25eV 下提
@
H D2J1RV3gn 取的一张质谱图;E. 在CAD 碰撞能量60eV 下提取的一张质谱图。^y/L@c9{n
5
x$YR$w9bAh,k 二○○五年·第一期综述与专论;gj!K
n*_+`8H}K-P
. 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
2M:W3tZ!d 　　与一般的中性丢失扫描方法不同,EGNLS 不使*zh1o&t1BRS#fAg6|
用一个固定能量而是建立一个能量梯度对复杂生物!G(t|Y#V,NP C3I
样品进行快速连续的扫描,从而在能量梯度扫描谱L7F
n Z aV
图上达到对不同结构化合物的迅速分离。然后根据
,h(mo9T$s7m 需要可以使用LC/MS/MS 对发现和分离的目标化合|e-Jm9f,V
物进行进一步的分析。EGNLS 方法的优点是: (1) 因
*AEN7Y x
gQ,Zz!u-cks 不同化合物在同样CAD 条件下会有不同的OCE ,通%iO3?O8RL^y e S
常的固定能量中性丢失扫描方法容易丢失目标化合
c_}d|VtE 物;而EGNLS 扫描过一个能量的梯度,从而避免这
RlY5N!h~x$Sq? 种情况的发生; (2) 利用EGNLS 不仅可以快速寻找
x&?#G&Ev8R}M 生物样品中某一类化合物,而且通过不同类型化合
c t9@.J5NG;r9g/z/g"F
物的OCE 对找出的未知化合物进行分离,并得到未 Bt:I*]mux
知化合物在结构方面的进一步信息。(3) 在找出未7{NEFox@)Rvi
知化合物的同时,测定出其OCE 数值和母/ 子离子
5mN+`+Q2q 对信息,利用这些信息,无需优化MS/MS 条件即可
7Od8}H@$Q 直接进行进一步的LC/MS/MS 分析。
^9ep4Q[U 利用EGNLS 方法,分别对一些未知植物样品soEtJQ3O8u-lp
(如稀有产地的黄芩和生物技术制造的杂交人参须
5a_(?'u&E 根) 中的苷类进行快速分析,无需复杂的植物化学分Z[1T
{hvv
离提取,直接分析生物基质样品,即得到有效成分苷zN'nM3z E5N
类的组成和比例等信息2 。另外,通过对照分析已知
B+})]{+H S 的黄芩和人参植物,证明EGNLS 方法还可以用苷类#Q}Lhf(u'v9Ww[h6}
相对比例来快速鉴定同属植物,并与充分分离的 o4S8r X%Az%i0y
HPLC/MS/MS 研究结果一致3 ,4 。1mP/w,q6G'm
2 　最佳碰撞能量下多反应离子对峰面积法{*c.r$_NiqX&~'V
(PAMT2OCE) y%n6d*E-Kx0~g
　　虽然质谱分析,特别是串联质谱具有较高的选(ZQ*s9SCP5z
择性,但是在由于生命分析面临的分析对象的复杂}[+O9x0Eq
性和未知性,有时候也会出现严重的干扰,例如碎片 O{3m3S|IFd
相似的同分异构体以及生物基质中的未知干扰物
B!j {g L 等,现有的质谱方法还难以克服,这时候必须依赖充
_"Oa"jsWh 分的色谱分离或者复杂的样品处理才能消除干扰。Ht|~ I h1m#J
这就至少提出两个问题,如何评价是否存在干扰?
.i.n)f!j,SB \y.H 在存在两个相互干扰(如含有相同碎片的同分异构8I
{,XC,ZmW]Q
体) 时能否通过简单的方法区分它们从而实现快速'H9ek^owp4b-g
分析? 最佳碰撞能量下多反应离子对峰面积法
9@U] S QT9s$@)F (PAMT2OCE) 提供一种参考的方法。
0r\v7Z1~Y:K xx 一般认为, 电喷雾串联质谱碰撞活化解离
-@4F8I!UX (CAD) 得到的碎片强度是不稳定的,随着碰撞能量、
H/`(G_u 离子化条件的变化,子离子碎片种类和丰度也随之
(}OF |!gO0yyN_z 显著变化,因此,与EI 固定能量图谱不同,ESI 质谱E"n8[,~c"wO
CAD 谱图很难进行相对丰度比较。基于前面OCE
bt?T)qp
} 稳定性的基础上,研究几十种模型化合物在ESI 串
%RY q~_CKL 联质谱中的CAD 行为,每种化合物可能存在丰度较|d(X%r+}6~#? c
大的多个子离子,采用多反应监测(MRM) 模式,选Hv)m[P6y
择多个质谱反应在各自的OCE 下考察其峰面积:h9f7^;L }K/AR-?e
(Peak Area of Multiple Transitions) ,结果发现其相对
-u.Gl2QM1K9_t 强度非常稳定5 ,6 ,而且这种稳定性与样品所处的基A
L8G!\${4B!B}
质复杂程度无关,多个子离子流的相对峰面积比'UJ,Av(y^4QJq1jK
RSD 一般在5 %以内。这种稳定性需要满足的条件
$x,c5KJL3{W'u 是: (1) 每个子离子的离子流都在OCE 下获得; (2) :[b;n4}4sH.[2d7iM7w
离子的相对丰度不低于2 %; (3) 强度最小的离子流
am2P0b(J 信噪比大于10 。作者认为产生此稳定性的原因有Q~H\8M[7W;H
两个方面: (1) CAD 反应在其OCE 附近有一个强度
Xc}_(`!Kc1@X 相对稳定区; (2) 一个离子的CAD 反应特性只与质"jA;m5U%Mi
谱条件和离子本身特性有关,与离子进入离子源之^)C,]+l%\w}2i'?J
前的历史无关。P9s
Ur4X't,h/zF
利用这个特性可以显著提高串联质谱化合物定
UH;X'y|1}&E 性的可靠性,采用PAMT2OCE 方法判断串联质谱分Uy6v|QN9j6R3aO
析的结果是否存在干扰,并且可以在不分离的情况0?j oY c|"c_-H#vR5TU
下高速鉴定、分辨其子离子基本相同的同分异构体, @o2e'u Ag
`
甚至可对两种共流出的同分异构体进行定量分析,
E?qk Y RSD 在10 %以内,回收率在90 %～110 %6 ,而这是普
iyk:U3{-k+U 通MS/MS 方法所不能做到的。例如,在不到1min $H6|
Z\{Q)g
的分析时间内,成功的分辨几对同分异构体亮氨酸eNM)o:k*NH4gs
和异亮氨酸,人参皂苷Rg1 和Rf ,甚至手性异构体0O g/\B-d&?
麻黄碱和伪麻黄碱等,而通常方法需要20～40min 8k^b+i4F
色谱分离的LC/MS/MS 来区分这些异构体。与9cO&x:O ^Fo/If
HPLC 方法和常规的LC/MS/MS 方法相比,本方法具/ip:PZ:g][
有高准确性、高通量、可直接测定复杂基质样品、无
XcE?G 需前处理的优点,而且可以大大减少“假阳性”结果
,vZZAY 出现。此方法可以应用于制药、生物、环境领域中的 iy+m"Y0Z
大规模、准确、快速的化合物筛查。
3d3Q7N}j 3 　挥发性离子对反相色谱2串联质谱法(VIP
e MUm#_V%C - HPLC/ MS/ MS)
3B+Cd,?1x4Y.E^)D)q{ 　　LC/ ESI2MS/MS 在应用中,往往HPLC 的分离效Kt']O5{
能大大低于常规HPLC。主要原因是应MS/MS 对离_h4HWDDo
子化的要求,常规的流动相改性剂多不能应用于/c \(B.q^#W$tx] bt
LC/MS/MS 中,从而大大限制LC/MS/MS 的选择性。
\n Ev_ 因此作者提出挥发性的流动相改性剂LC/MS/MS 方
?
[T4vQrl 法,研究使用挥发性的流动相改性剂提高LC/MS/ &~.[\\*M[fy
MS 的色谱部分分离效能,同时不损害ESI 离子化的
2|*T6~u,x(IvBv 效能,提高LC/MS/MS 解析复杂生物样品的能力。
3Sr4`/u }N6p 以复杂生物样品中氨基酸的非衍生化分析为例,对!R
ob`8y5n
此方法进行应用7 ,8 。
~9G~6_/?$kNV!`2B 6 bW(HC l;Q"[L
现代仪器二○○五年·第一期 {KP(}-He$xq/o2V
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时间/ min
}"`z!] AjN 图2 　LC/MS/MS 定量分析人血清中22 种非衍生化
#t,g.j,Ch[u&E 氨基酸(AA) 离子流色谱图,a,vH&f4X/oR
　　A. 总离子流图;B. ～(J ) 代表性的提取离子流图。前9min 同时
U@!^B-w XJ&zr4m 监测9 种AA;接下来21min 监测8 种AA;最后6min 监测5 种AA。
1nkk(l?fW#bD 由于氨基酸的特殊性质,很难在反相柱上用常6l _0j!r\6eR_
规方法得到很好的分离,而且多数缺乏发色团,不能\7n+Q?%Y(S0O
直接用UV 等检测。MS/MS 可作为潜在的未衍生氨
6k` q*z| mcl 基酸检测器,但因ESI 离子化的要求,目前分离未衍
N+m-[8r'Bq 生氨基酸的手段无法与MS/MS 直接相连。故此目h5jr5m#R4~4{6z
前测定复杂体系中的多种氨基酸一般对其衍生以提
2k'R9[$l#\T)frI 高其分离、检测性能,但衍生化的缺点是费时费力而gLRY2M1Gp
且损害准确性。使用两种全氟长链有机酸( PFHA -]2OGI-BT+mP
F
和PDFOA) 作为流动相改性剂,首次实现在反相柱
#qG)t S/|^ 上对22 种未衍生氨基酸的有效分离,并结合多对反,sf T'tr:o3g
应监测(MRM) ɑ2
1G&D"ec6j)Jh 氨基酸特有的中性丢失( - 46) 作为
bu"l7E,{k 检测手段和稳定同位素稀释法作为定量手段,首次
Y5A-Bu?q 实现直接定量血液样品中的22 种未衍生化的主要
3J0K.OP6| A$XHHa*j 氨基酸(见图1) 7 ,这可以说是氨基酸分析方法的一
TXGg$R 大进步。本方法也可应用于发酵液中的氨基酸非衍/_yVw&@KZ T~$cj
生化快速分析8 。
0m2J6L.GV:~}f 4 　展望3_QX~&ex'N`
生物质谱是生命分析化学的关键技术之一,广t-w N'?n$N
泛应用于生物医学研究、临床检验、药物分析等生命
I {\NfU;x 科学领域,例如血清中生物标志物的快速检测9 ,遗
z~eY8El 传性代谢缺陷疾病的快速筛查10 ,11 ,中药研究3 ,4 ,12和1_"p@.]%P*`2o@
药物的体内分析13等。近年来,蛋白质组学和代谢
3qf |0|,|G
W_!N^/n 物组学成为生命科学的研究热点,但目前的瓶颈问;Bst5o5\z~
题仍然是技术和方法问题。近20 年来生物质谱技
g.Y:ok7I+HU-|j5C b 术发展非常迅速,目前已经成为蛋白质组学研究的#]"dX_pM$D1^R
核心技术,在刚刚兴起的代谢物组学的研究中也显b&beX#nT
示突出的优势。正如人们所说的“21 世纪是生命科
i0nhbK!k0J 学的世界”,与此相对应,必然带动生命分析化学的
e0F5@C2t)i-q 快速发展。从目前生命分析化学的发展现状和趋势
m`*y3[3d{"VuE 看,几个前沿领域和要解决的关键科学问题,包括生
Z\`uN 物大分子分析(如蛋白质组) ,小分子分析(如代谢物*g0d_3jh%|xe
组,药物小分子等) ,以及小分子与大分子的相互作
Xd-sGNX{:z6I 用(如化学生物学研究) ,而生物质谱具备上述各个
"V4l1x"^%V/}a 领域应用的潜力,必将在生命分析化学的发展中发
Y1S*EWXF 挥更大的作用。

深水 发表于 2006-11-6 21:04

自己顶自己

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