化学发光免疫分析技术的研究现状与展望
近10 多年来, 当代生物技术的研究和应用取得高速发展的同时, 也大大推动了化学发光免疫分析方法(chemilumi2
nescence immunoassay , CL IA) 的更新换代速度。因其具有简
便易行、标记物制备非常容易、稳定性高、便于实现完全自]H |%cr'\U C }H;A
动化和不污染环境等优点, 特别是能在较短的时间内得到实
验结果, 因此深受检验医学工作者和临床医师的好评。本文 T,nD+h Z
就CL IA 的发展历程、研究现状、不同方法的评价和前景预
测作简要评述。]#^+r9c-z)g8P#Ed
发展简史Z n G$M^#Wl#_
化学发光(chemiluminescence ,CL) 早在19 世纪80 年代就
得到证实,即在化学反应过程中瞬间以释放光子的形式放出能VB }I{8o!M_0O]
量。但这一特征未受到人们的关注。直到20 世纪60 年代初,0bzu1p4`CW F B
Yallow 和Berson 创建了具有划时代的放射免疫分析技术( ra2
dioimmunoassay ,RIA) ,因其高灵敏度和高特异性而受到普遍4u)C8~ G O+l
应用。CL IA 是在RIA 基本理论的基础上,以标记发光剂为示%uK | bjRe"j
踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。早期的
CL IA 具有和RIA 相似的特异性,但灵敏度低于RIA。1978xh8gt D ~"u d1? ` J
年,自从Halman 成功地建立了CL IA 以来,经历近20 年,经过!n8r Bc ]
许多学者的实验研究,相继应用许多新材料、新技术、新工艺以
及新仪器的研制取得成功,加速了CL IA 的逐步完善,目前已;e%@0F P9I-m}v?
广泛应用到基础和临床医学的各领域,成为取代RIA 的首选 M,a'Hc.uf4U Lq
技术。rP:]T1~Z Y*R
从早期提出到成为现代商品化的试剂和仪器,CL IA 大体
可划分为4 代。 V(QK'Df3gR
1. 第1 代:20 世纪70 年代,化学发光和生物发光作为示)j Hw&Cq
踪信号建立非放射性标记分析方法,在生物医学领域受到了高7g&h-Lh8D-i ]
度评价,成为超微量检测技术的一个热点,国内外学者大量的
实验研究证实,采用luminol 衍生物ABEI 标记抗原或者抗体,
无论是建立双位点夹心法还是竞争法,其灵敏度都达不到RIA
水平,且所发射的信号为闪光,持续时间很短,受当时科技条件 dWuev^6}W
的限制,完全靠手工操作,试验条件难以控制,未能达到临床应XA(z2Bb
用水平。y2s O$~p"_ s
2. 第2 代:1985 年,Amersham 公司研究人员针对第1 代
CL IA 存在的灵敏度尚不够高及闪光信号难以控制测量等因a b#jAqr [:i
素,提出了以辣根过氧化物酶( horseradish peroxidase , HRP)
标记抗原或者抗体,当免疫反应完成后,加入含有对2碘酚或
对2苯酚的luminol2H2O2 液作为发光底物,可将luminol 所发
出的闪光转化为辉光,发光信号可持续10～20min ,并且显著q1i;_7tV5NI)a:[
提高了发光信号的强度,从而提高了检测的灵敏度。人们曾将q s6c ^q(L u
这一方法称之为“增强发光酶免疫分析”。Amersham 公司虽
研制出10 余种试剂盒,因操作不够简便,检测项目仅限于蛋白
质类大分子化合物,未能广泛应用于临床。TBzw0s4@"pK Y'c^
3. 第3 代:早在20 世纪80 年代中期,国内外学者的实验;zs n-Kn;q
结果显示,吖啶酯衍生物是理想的直接标记抗体或抗原的发光
剂,有较高的光信号,因瞬间的闪光,受当时测量仪的限制,未D)?kO t.xL)@'~
能适应临床样本的检测。Ciba Corning 公司的ACS180 自动
CL IA 系统研制成功是为精确测量闪光而创造的最佳条件。
拜耳公司制造的与之相匹配的试剂盒已投放市场,近10 年来,
取得了公认的良好效果,从此实现了CL IA 的完全自动化。
1989 年,Thorpe 等报道,金刚烷衍生物在碱性磷酸酶作用下可 v!Nq0q ma S
发出高强度的辉光,光信号可持续1～2h。随后国外生产厂家4G]5c#Q5s,xI7p y*F
研制出以碱性磷酸酶为标记物的试剂盒,与之相匹配的有!N.HV bp
DPC 和Beckman 全自动CL IA 系统。在HRP 催化发光持续
时间方面的研究,最近有国外文献报道采用新的增强稳定剂也1O*S J$_*V.K#v%u
可使HRP 催化luminol2H2O2 所发出辉光持续到1h。这类新
的增强稳定剂系在苯酚环的对位上取代1 个或2 个杂环,如42
(2 ,2′2二甲基噻唑) 酚,目前这类试剂尚无商品提供。-w9@C"ZG0B y2S
4. 第4 代: 第4 代CLIA 应属于电化学发光免疫分析
(ECLIA) 。它于20 世纪90 年代问世,是一种与上述发光原理
完全不同的新型CLIA ,ECLIA 是集电子发光技术、纳米微粒子7E9lV ed1a q,XCO6{
技术、生物素2亲和素系统、抗原2抗体免疫反应、电磁场分离整m9tE*i1K3S&[cA
合为一体而设计的一种自动化标记免疫分析系统。目前国内引 dl2Z w(Z u3o9o
进的Roche 公司产品ECL 代表当代ELICA 自动分析系统。主
要特点是本底信号极微,特异性更高,最小检出值可< 1pmol ,操mc8_$X J G0g I q&r&f
作十分简便快速,是CLIA 优点较为集中的完美分析技术。
目前,临床样品检测采用CL IA 技术主要是吖啶酯标记物 R'Ey8}&W
直接发光、Apase 、HRP 催化底物发光和电化学发光3 种发光
类型。电化学发光原理研究者认为实际上不应列为化学发光,
因为其未通过启动发光剂或者激发发光底物,从激发态回到基
态而放出光子,而是依据三联吡啶钌Ru (bpy) 2 +-YZJ4{p.Q f3A
3 和三丙胺,在.?S.kqU
电场激发下的化学发光反应。有关CL IA 的基本原理在一些
文献中已有详述[1～3 ] 。1f"R S%d#|7T"P
当代CL IA 的技术参数和特征tn,_+b m7z5U
1. 不同型号CL IA 自动化分析系统: 近年来, 国外许多
厂家研制出多种型号的全自动化CL IA 检测仪, 人们将这类
仪器称之为自动化分析系统, 即检测过程不需要人工操作,
均由仪器完成。各种类型或厂家的产品其技术参数略有不同,D%o5U\(W9rD"W
见表1 。7w&J'q u6o{
2. 3 种CL IA 比较:根据化学发光信号产生的原理不同,
试剂盒的技术参数、信号测量也因之不同,以及影响检测结果!u"@(}I7N`z
的因素也有一定差异。3 种目前常用的CL IA 比较 3. 两种不同酶促CL IA 方法比较:在酶促化学发光免疫分 H3p wn_
析中可供标记的酶有多种,除常用的Apase 和HRP 外,还有
文献报道,采用次黄嘌呤氧化酶作标记物已应用于CL IA ,其
最小检出值可达1pg ,另有学者报道以半乳糖苷酶标记抗原或[1?i8hi-\eku-k
者抗体,也有很高的灵敏度。根据来源容易、价格适中等特点,
选择最多的是酸性磷酸酶(Apase) 和HRP。
4. CL IA、时间分辨荧光免疫分析( time resolved fluores2
cence immunoassay ,TRFIA) 、酶免疫分析(enzyme immunoas2
say ,EIA) 试剂盒技术参数比较:近年来,非放射型标记免疫分
析技术研究和应用发展迅速。有关这方面研究所提出的作为 z*co&y W T7j
示踪剂的物质有多种。许多试验结果证实,从简便、实用且适-m4Xl`,uB+O
宜大量样品检测,并已实现商品化试剂盒的,主要是CL IA、
EIA 和TRFIA。三者的主要特征见表3 。
CL IA 技术有关问题探讨4NNrS4t2\'m
1. 不同方法检出值的差异:影响检测结果差异的因素较
多,如试剂盒的质量、有效期、贮存条件、操作者对仪器的校准、
实验室的条件等。不同反应模式对测定值有统计学意义,最常
见的是双位点夹心法和竞争法,因前者使用两株单克隆抗体,EE+v[w m+yM4|
具有高度特异性,测定值低于竞争法。即使采用完全相同的反 ~%i%h-q`z ju @9]-W
应模式,因抗体的特异性和亲和力的不同,对测定值也有一定
的影响。另外固相抗体的制备、标记物的比活性、标准品的差
异都是影响测定值的因素。P-B_ E E&j+a
2. 自动化分析系统和自动化测量的比较:自动化分析系统:g/P"T ^ a&th
和自动化测量两者的不同是检测程序的差异。前者全部操作
流程完全由自动分析系统完成,而后者仅在完成免疫反应后由
仪器自动测量光信号和数据处理。自动化分析系统影响检测 h&C'p L:@ Y9~
值因素少,简便快速,非常适合于大量样品检测,且为封闭式,1b8m c`3A5k+a[(f$dpA
必须和进口试剂匹配,价格昂贵;自动化测量为开放式,自行研展 望%h)p5D2q&WF1W$X
1. CL IA 试剂盒技术研究展望:CL IA 的技术优势已被大o4R+i$n _M$^
量实验研究结果所证实,随着开放型自动测量仪器的完善,必
将为生物医学研究工作者提供开发和研制CL IA 试剂盒的条
件,从而打破国外大公司对试剂的垄断。根据现有的文献资 O&g6Mg0n9nd
料,试剂盒质量的进一步提高,可能在以下几方面研究: (1) 磁IL8nU:_(g9{.g3g
性微粒子的应用:磁性微粒子在CL IA 中的应用已取得成功,
它是以共价键结合取代物理吸附制备固相抗体,具有表面积6z bb y cJ
大、活性基团多、结合牢固、免疫反应结合快等优点。目前纳米
磁性微粒子已有商品上市,国内尚在实验阶段。此项研究和应T*TC"[?7Rk`
用将标记免疫分析提高到一个新的水平。(2) 免疫反应增强剂y%C3Tju|F
的研究:早在20 世纪80 年代,已有文献提到在抗体抗原混合
液中加入一种杂环结构的衍生物,可以加速抗原2抗体的免疫(Y;f)I*\j1g#_-fMu,S`
反应。这类试剂称之为免疫反应增强剂,其试剂名称和用量至 Y$m#hGsPoX8k
今未见述及,很可能系生产厂家的自主专利。如此项研究取得成功,将缩短检测所需时间,为临床应用提供方便。(3) 单克隆IRp;k y!w2l Uk,{W
抗体(monoclonal antibody ,McAb) 在小分子化合物的应用:双a6V q&i7M q+sN _
位点夹心CL IA 应用McAb 检测大分子化合物,其高特异性、
高灵敏度和高稳定性,目前已被公认。应用McAb 检测肽类h"G5f @3rqRx u(HI
和半抗原,文献报道尚少。最近本研究采用肽类C 端和N 端
两株McAb 完成了C2肽双位点夹心CL IA 试剂盒的研制,对半jI\6N)e v E
抗原E2 采用荧光素标记McAb ,以包被荧光素抗体作分离剂, F0[z7}%aL+G Y x S
与直接固相竞争法进行了实验对比,取得了较满意的结果。初 }2Qb A,ZN
步结果提示,以McAb 取代多抗,对标记免疫分析试剂的质量 k^w$PQ*S'x@"u
将有所提高。特别是采用双抗体夹心法检测肽类化合物,其高
度特异性是其他技术无可比拟的,无论是对基础医药学研究还
是临床疾病诊断都具有重要意义。(4) 新的发光剂的研究和应
用:国外对发光剂的研究进行了许多系统实验观察,吖啶酯发
光和酶促发光应用得最多,前者为闪光,测量快速,主要适用于
全自动CL IA 系统;而后者以酶促催化底物发光,受温度、时间+Ex/}N7]!Y"z
等因素影响,但发出的辉光,对测量的要求不高,适用于开放 b-],[2}7c5E2S
型。在发光技术高速发展的今天,新型发光剂的研究可能取得
进展,以闪光取代辉光是今后发展的方向。
2. 全自动化系统仪器和试剂:CL IA 自动化分析系统均为 F!sevEU
国外产品,最近国内大型医院相继引进,型号各异。其简便快*q"K;]P%R!S.e P1\
速,自动化程度,以及相匹配的试剂盒质量基本上在同等水平, Y*A}h5\
为大量临床样品检测提供了很大的方便。但目前所提供的试
剂盒品种不多,仅可供常规项目的检测,且价格高,难以普及。 CCpZ!a7H ?C'N
未来发展除逐渐提高试剂盒品种外,仪器智能化程度也将有所 F.X\-pJC
提高。
3. 其他领域研究:自动化发光测量仪器的研制近期已取得
快速发展,因价位低、开放型、不同规格的试剂盒都可检测,非ZQ/x&xg/O5i
常适合高等院校、科研单位和中小型医院普及CL IA。从现有的精密仪器制造水平来看,设计并开发出微型CL IA 自动操作$zMsY|Q j
仪和现有自动化测量相整合为一体,成为一种开放型微型自动
发光检测系统,除广泛应用于生命科学研究、中小医院临床常 a;b M J0xF [
规检验和防疫机构外,最近的文献显示,在农业、环保、地质、军
事等领域的应用也有很大的发展空间,特别是和其他技术,如
气相色谱、电子传感器等联合使用,大大扩大了化学发光技术 t$])~'Ter
的使用范围。 GH l;z0f:om2@sA
小 结
RIA 的问世开创了超灵敏度检测技术的新纪元。在此基DK X'Rgb \ }ab4uK
本理论的基础上,相继派生出一系列非放射性标记免疫分析方
法,既保持了RIA 的优点,又克服了其缺点。非放射性标记免(p{~:q.JF-M
疫最常用的依次为CL IA、TRFIA 和EIA。
进口CL IA 自动化系统各型号已占领国内部分市场,主要 |%G D%v0g bf2T
用于大量常规样品的检测,全封闭式仪器需与其匹配的试剂盒w"wf It QVbnq;Z
使用。近年来,国外仪器制造商热点已转向开放型自动发光测Zd` Yj(N Y H9qP/Z
量仪器的研制。国内在仪器制造和试剂盒的生产,和国外相比6l};a:KA,S7Z
有一定的差异。自动化系统的研制为国外专利,现阶段国内厂
家重点应放在现有自动测量仪器质量的提高上,完善数据处理$d5~$GHt^g
功能,研制出高质量的试剂盒。这方面的工作目前国内已取得j"P*`){R!|;cq7t
初步成果。展望未来,小型智能化CL IA 仪器随着我国高新精
密仪器制造业技术的进步,微型自动化CL IA 系统的研
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