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waterdp 发表于 2007-3-1 20:38

免疫细胞化学常用试剂介绍

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waterdp 发表于 2007-3-1 20:38

　8．几种常用的不同pH值缓冲液的配制表　　（1）0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）
w5BlG(N|R,{:? [table=98%][tr][td=1,1,33%][align=center]pH[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]0.2mol/L NaH2PO4(ml)[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]0.2mol/L Na2HPO4(ml)[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]5.7[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]93.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]6.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]5.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]92.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]8.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]5.9[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]90.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]10.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]87.7[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]12.3[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.1[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]85.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]15.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.2[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]81.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]18.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.3[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]77.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]22.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.4[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]73.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]26.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]68.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]31.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.6[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]62.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]37.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.7[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]56.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]43.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]51.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]49.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]6.9[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]45.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]55.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]39.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]61.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.1[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]33.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]67.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.2[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]28.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]72.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.3[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]23.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]67.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.4[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]19.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]81.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]16.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]84.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.6[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]13.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]87.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.7[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]10.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]89.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]8.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]91.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]7.9[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]7.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]93.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]8.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]5.3[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]94.7[/align][/td][/tr][/table]　　(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.19～9.10）wL}{
l9Es7h~0Ta5c
[table=98%][tr][td=1,1,25%][align=center]pH[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]0.2mol/L Tris(ml)[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]0.2mol/L HCl(ml)[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]H2O[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.19[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]18.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]12.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.36[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]17.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]13.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.54[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]16.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]14.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.66[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]14.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]15.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.77[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]14.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]16.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.87[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]13.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]17.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.96[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]12.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]18.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]8.05[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]11.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]19.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]8.14[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]20.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]8.23[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]9.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]21.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]8.32[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]8.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]22.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]8.41[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]7.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]23.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]8.51[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]6.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]24.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]8.62[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]5.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]8.74[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]4.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]26.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]8.92[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]3.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]27.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]9.10[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]2.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]28.0[/align][/td][/tr][/table]　　(3)0.2mol/L醋酸盐缓冲液（pH3.6～5.6）
(g%HURD`B6cil [table=98%][tr][td=1,1,33%][align=center]pH[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]0.2mol/L醋酸（ml）[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]0.2mol/L醋酸钠（ml）[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]3.6[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]46.3[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]3.7[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]3.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]44.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]6.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]4.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]41.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]9.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]4.2[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]36.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]13.2[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]4.4[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]30.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]19.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]4.6[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]25.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]24.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]4.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]20.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]30.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]5.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]14.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]35.2[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]5.2[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]10.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]39.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]5.4[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]8.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]41.2[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]5.6[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]4.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]45.2[/align][/td][/tr][/table]　　(4)0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH5.0～7.4）
!u[_? N6` f#e [table=98%][tr][td=1,1,25%][align=center]pH[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]0.2mol/L二甲胂酸钠（ml）[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]0.2N HCl(ml)[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]蒸馏水[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]5.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]23.5[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]51.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]5.2[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]22.5[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]52.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]5.4[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]21.5[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]53.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]5.6[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]19.6[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]55.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]5.8[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]17.4[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]57.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]6.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]14.8[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]60.3[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]6.2[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]11.9[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]63.1[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]6.4[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]9.2[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]65.8[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]6.6[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]6.7[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]68.3[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]6.8[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]4.7[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]70.3[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.0[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]3.2[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]71.8[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.2[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]2.1[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]72.9[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,25%][align=center]7.4[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]25[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]1.4[/align][/td][td=1,1,25%][align=center]73.6[/align][/td][/tr][/table]　　注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸钠-HNO3缓冲液。
sT`ejHAYA
　　（5）0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）?@)U
`k7? v
[table=98%][tr][td=1,1,33%][align=center]pH[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]0.2mol/L Na2CO3(ml)[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]0.2mol/L NaHCO3(ml)[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]9.2[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]4.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]46.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]9.3[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]7.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]42.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]9.4[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]9.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]40.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]9.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]13.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]37.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]9.6[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]16.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]34.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]9.7[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]19.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]30.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]9.8[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]22.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]28.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]9.9[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]25.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]25.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]10.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]27.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]22.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]10.1[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]30.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]20.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]10.2[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]33.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]17.0[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]10.3[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]35.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]14.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]10.4[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]38.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]11.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]10.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]40.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]9.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]10.6[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]42.5[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]7.5[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,33%][align=center]10.7[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]45.0[/align][/td][td=1,1,33%][align=center]5.0[/align][/td][/tr][/table]

waterdp 发表于 2007-3-1 20:38

　三、显色液　　免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：
.zWHX"H1W4o 　　1．DAB（Diaminobenzidine）显色液qR
c8v(r(Bf'L
　　DAB即3，3-二氨基苯联胺
-M?lOS0E 　　试剂：DAB（常用四盐酸盐）　50mgDp_!L,p rS
　　0.05mol/L TB 　　　　　　　100ml
s)]x6v/eV]4K 　　30% H2O2　　　　　　　　　30～40μlc4]i7hY X
　　配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01%。8UY)e6om
　　DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
"qD\Da 　　2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液
4B `UJw z 　　配方1：4-Cl-1-萘酚 　　　　　　　　100mg
"y h] wk
s*?x ?(L 　　纯乙醇　　　　　　　　　　　　　　 10ml
s x$^7C-M%S3} 　　0.05mol/L TB(pH7.6)　　　　　　　　190ml
&b+up$c&~%_\s,C6Q 　　30% H2O2　　　　　　　　　　　　 10μl(0.003%)
$k$q(IVf^ w 　　配制方法：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其终浓度为0.005%，切片显色时间通常为5～20min。s)w P%O3L4J9j%C
`[
　　配方2：4-Cl-1-萘酚
FO0B6jyQ%H!f4h9g(k 　　N-二甲基甲酰胺（DMF）
p&a*@@oKg-w p 　　0.05mol/L TB(pH7.6)
9R}2aqhVn{ 　　30% H2O2
G]8Q-yp#~,G} ^B 　　配制方法：先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加热溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后加入H2O2，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于50℃时才放入组织标本（注意：温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀）。显色时间通常为5min左右。X)]!iFYd2I
　　4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。
c/}V~I+R8Fh 　　多数认为最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。b)?a+i\2Zf
　　3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）显色液
-r{#h@H#TV"E;`'q 　　试剂：AEC　　　　　　　　　　　20mg.LxbV`{
M
　　二甲基甲酰胺（DMF）　　　　　　2.5mlU8pL9D$vqMF3k
　　0.05mol/L醋酸缓冲液（pH5.5）　　50mlH$u"yY"d-qv"k4m
　　30%H2O2　　　　　　　　　　　　25ml i"V7B9^ L+d5D
　　配制方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入30%H2O2。切片显色时间为5～20min。
K/\Fw+u1hX]r 　　该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。0iE?K^9T
A2C@
　　4．TMB显色液uMl |Z7J6RF2s,a
　　试剂：TMB
!j.n:r/UrimP 　　HCl#?j}x0lJ7X,L
　　亚硝基铁氰化钾3?h.Yy%b |:m5ym
　　无水酒精
VP*p(H-]+n G3l!X 　　配制方法：zT c.Qc8j4q4q)p7L
{
　　（1）醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。
&P.SO s!eq 　　（2）A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml混合。:W;}Nrq
　　（3）B液：称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
A7I,F ?0Y0n$^ k 　　（4）孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于试管中充分混合。（液体在20min内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染）。酶反应时，加入终浓度为0.005%的H2O2。
Fi{qd |hj$f 　　（5）主要显色步骤：组织标本在蒸馏水（或PBS）中漂洗数次（每次约10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml）继续孵育液20min左右（19℃～23℃），捞出标本漂洗数次（共30min左右）。在0～4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴片、脱水，封片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁（pH3.3～3.5）中负染5min后贴片、脱水、封片。cBjeQ2Q lU
　　TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。 Uw7x4~B*C \2{B
　　5．NBT显色液G5m!iD(~-B
　　试剂A液：5%NBT：称 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）内，充分混合，常存于4℃，也可装成小份，-20℃保存，用前复温。\(`.rM0z:Q6D1~t
　　B液：5% BCIP：称取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF内，混匀。4℃或分装存于-20℃，用前恢复至室温。
T,~7x.{'F 　　C．显色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,钤0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管内，充分混匀；再加入B液40μl，轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。Par4| NWN
　　NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。4oZ6rp,C4u.T!`
　　四、粘附剂
9JEq/w] 　　在免疫细胞化学工作中，由于标本（如切片）的脱落常影响工作的质量的速度，故粘附剂的选择和使用就显得较为重要。&@-wx$Hhq$A
　　1．铬矾明胶液8r@#u!t7B,I&M2]
　　试剂：铬矾　　　　　　　　0.5g_T%@3Daa,\BY
　　明胶（Gelatine）　　　　　5g:`2i
Q0Zf!p$Q
　　H2O　　　　　　　　　　 ~1000ml
?a%\9])E3f 　　方法：在1000ml的烧杯或烧瓶中，以500～800ml H2O加温溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊，包被玻片时最好控制水温在70℃。如有明显残渣，过滤后使用。:j:Bhy`Crnz
　　2．甲醛-明胶液7z!z;d:e7f8[{6q.S.|Cs
　　试剂：40%甲醛　　　　　　2.5ml
/_$asZ;tl2cT J$i 　　明胶　　　　　　　　　　0.5gk4`b n {
　　蒸馏水　　　　　　　　　至100ml
!G\B)_;EFB:K 　　配制方法：用少许蒸馏水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml混匀即可。
1Tl_7b$Eu`~ 　　3．多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）
%[u1k6x#u/A-j_ 　　试剂：多聚赖氧酸　　　　　 5g/dN ?b9K)SH%_
　　蒸馏水　　　　　　　　　　 ~1000ml
4F'I.kG!oJ8O 　　配制方法：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成0.01～0.5%浓度。4℃保存，也可-20℃备用。PLL可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释10～50倍。
-zK4I*Y@^2g-g^ 　　4．Vectabond试剂　　该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒（7ml）可配成350ml工作液（用丙酮配）。处理载玻片前（事先酸处理），用染色缸装好各种液体，按下列程序进行：;c Y(w8ES1u&[c)U
　　干净载玻片→丙酮5min→Vectabond试剂工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮）：将载玻片用镊子夹住浸入Vectabond试剂1～2次→dH2O，2×5min→干燥（37℃过夜）→用铝箔包好，室温存放备用。/Q"DXVZ$M
　　注意：避免污染（尘埃等）。F"Y2G-zU3~,f0e(aD
　　综上述方法处理的载片一般可存放半年以上。
S5|1A_.T1kf+^}5q,v 　　五、封固剂
6\"Dw2N,Y9w{0CVT;j 　　1．甘油-TBS及甘油-PBS&g~GO7r5d3O7t
　　[img]http://www.39kf.com/uploadfiles/image/13601/TXT-20061135556343.jpg[/img]0F(v'j"[M8@J!i%Xe!X9xA
　　配制方法：按比例将甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4℃，冰箱静止；待气泡排除后方可使用。
yqK R&A\ 　　2．甘油-明胶（冻）
!Br+y&S
D$CQi)MT 　　试剂：明胶　　　　 10gOMY:hU,[E
　　甘油 　　　　　　　12ml
&g9yB"~0J^5vX5H 　　蒸馏水　　　　　　 100ml
S0?bP!|4Yq$r 　　香草酚　　　　　　 少许
K;tP*y+a_$i
　　配制方法：称取1g明胶于温热（约40℃）的蒸馏水中，充分溶解后过滤，再加入12ml甘油混合均匀。少许香草酚是为了防腐。!s\Bg3~)tK
　　3．液体石蜡　　液体石蜡因含杂质少，很少引起非特异性荧光，故常用于荧光组化及免疫荧光法时标本的封固。
,ACzkOW^ 　　4．DPX8Q%W%Nu'ak
　　试剂：Distrene 　　　10gc&@&\
?n/Zq
　　酸二丁　　　　　　　 5ml
~dm6FqMFc Z 　　二甲苯　　　　　　　35ml
:W\{`}KUv1m 　　DPX为中性封固剂，用于多种染色方法匀不易褪色，但组织收缩较明显，故应尽量使其为均匀的一薄层。DPX现有商品出售，可直接应用。若感过于粘稠，也可加少量二甲苯稀释后应用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯挥发后，片子上出现许多干燥的空泡，影响观察，遇有这种情况，可用二甲苯浸泡掉盖玻后重新封固。+M0ovA2SAU/h._
　　六、酶消化液
:j0o-TDZ$?2|i 　　1．0.1%胰蛋白酶
u?)~4[AD 　　试剂：胰蛋白酶 　　　　　0.1gm\"{NT2`O
　　0.1%氯化钙（pH7.8）　　　100ml6p.ce4b.\2a a%NX
　　配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃（载有标本的玻片也在TBS中予热至同样样温度）。该消化液时间约为5～30min。
Hx:~!jJ%p]!R 　　2．0.4%胃蛋白酶HJ'Ucr6j2[6e$`5i
　　试剂：胃蛋白酶 　　　　　400mgWp1KZH R6Oe
　　0.1N HCl　　　　　　　　 100ml
"v(Fk4`9EP`/P.^ 　　配制方法：同胰蛋白酶。消化时间在37℃约为30min。'a%BjoZ
　　3．0.06% Pronase
kA*G(J.p0K i(|$S 　　试剂：Pronase　　　　　　　0.06g
P3bNb"tX 　　0.05mol/L TB(pH7.5)　　 　100ml
5x p*d"{d"],F-J%~~ 　　配制方法：同前。
n;r0VpNm"AU 　　在免疫细胞化学染色中，有时经Formalin过度固定的标本，常会产生过量的醛基，遮盖抗原，影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异，总之，在保持组织形态不被破坏的前提下，宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中，以第一种最为常用。
,Q:Z2@i$W%d 　　七、其它3x%[Cs HW
　　1．蔗糖溶液　　免疫细胞化学中应用的蔗精，常用浓度为5%～30%。一般光镜研究，仅用20%蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）处理，以确保其良好的细微结构。6C,O0A1J\-L]
　　（1）20%蔗糖液：
U6Il"eS
D[@ 　　试剂：蔗糖 　　　　　　　　　　20g
5e,_"C/r9^ 　　0.1mol/L PB(pH7.5)　　　　 　　至100ml
PNC \w:Y 　　配制方法：先以少许0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，置4℃冰箱保存。QQ[0}Z,L*O!geT
　　该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液，常浮在上面，当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。Ix4Z7F.u.H
　　（2）20%蔗糖-5%甘油：
.Z+^_)F_v1nM 　　试剂：蔗糖　　　　　　 20g
esAWl 　　甘油 　　　　　　　　　5ml2yE9T
o ~8A
　　0.1mol/L PB　　　　　　至100ml(约95ml)$Z)@B/[I;zTz
　　配制方法：先用少许PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混匀，最后补足PB至100ml，于4℃保存备用。
6MUIZ,o 　　该液主要用于电镜标本的处理，常浸泡过夜（其它浓度的蔗糖中常分别为2h左右）。
2h1gQ:[ ] 　　蔗糖是一种廉价的防冻剂，兼有脱水的作用，它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小，应用较为方便。若无试剂蔗糖（Sucrose）也可用普通蔗糖（Cane Sugar）。配制好的蔗糖溶液，放置时间超过一个月时，应重新配制。
/y~Ab bzLm | 　　2．T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)　　免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。
+S&}g1R L G~ 　　30% Triton X-100的配制：
3IR(K7n U2[&CgB^ 　　试剂：Triton X-100　　　　　　　　　　　　　　　　　28.2mlQ:p1Z%`[.X
　　0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4)　　　　　　72.8ml(bbw0XB}
~&GdD |
　　配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。-L,U'pYHDI
　　Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。 s8kQ7{^7OA+]
　　3．甲醇-H2O2液
\+XfG.?$ZX 　　试剂：纯甲醇 　　　10ml
UotypYD i 　　30% H2O2　　　　　 0.1mlT;p#t7I&|
　　配制方法：吸取30%的H2O20.1ml，加入100ml纯甲醇中，充分混匀即可，使H2O2终浓度为0.3%（也有的用0.03%、0.5%等）。a'i6~{\)]4]pm
　　甲醇-H2O2处理组织标本，具有封闭内源性过氧化物酶活性的作用，但其具体机制至今仍不详。通常处理时间在室温约为5～30min。注意，用H2O2处理标本，对某些抗原的抗原性有影响，故建议在使用新的抗血清或抗原时，最好同时设立非处理对照组。
D9y*OK pZ~ 　　4．常用生理盐液

waterdp 发表于 2007-3-1 20:39

[align=center]常用生理盐液的成分（g/1000ml）[/align][table=98%][tr][td=1,1,24%]　[/td][td=1,1,11%]Kerbs[/td][td=1,1,22%]Kerbs-Hen-selsit[/td][td=1,1,14%]Locke[/td][td=1,1,14%]Tyrode[/td][td=1,1,14%]Ringer[/td][/tr][tr][td]NaCl[/td][td=1,1,11%][align=center]5.54[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]6.92[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]9.00[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]8.00[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]6.50[/align][/td][/tr][tr][td]KCl[/td][td=1,1,11%][align=center]0.36[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]0.35[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.42[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.20[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.14[/align][/td][/tr][tr][td]MgCl2[/td][td=1,1,11%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.10[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][/tr][tr][td]MgSO4·7H2O[/td][td=1,1,11%][align=center]0.29[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]0.29[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][/tr][tr][td]CaCl2[/td][td=1,1,11%][align=center]0.28[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]0.28[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.24[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.20[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.12[/align][/td][/tr][tr][td]NaH2PO4[/td][td=1,1,11%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.05[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.01[/align][/td][/tr][tr][td]KH2PO4[/td][td=1,1,11%][align=center]0.16[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]0.16[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][/tr][tr][td]NaHCO3[/td][td=1,1,11%][align=center]2.10[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]2.10[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.15[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]1.00[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]0.20[/align][/td][/tr][tr][td]Glucose[/td][td=1,1,11%][align=center]2.10[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]1.00[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]1.00[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]2.00[/align][/td][/tr][tr][td]Pyruvic acid[/td][td=1,1,11%][align=center]0.43[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][/tr][tr][td]Fumaric acid[/td][td=1,1,11%][align=center]0.62[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][/tr][tr][td]Glutamic acid[/td][td=1,1,11%][align=center]0.72[/align][/td][td=1,1,22%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][td=1,1,14%][align=center]-[/align][/td][/tr][/table]　　配制方法：精确称取各种药品（如上表），加入500ml重蒸水中，待完全溶解后，补足重蒸水至1000ml，充分混匀即可。
YD5S!e%xK\^ 　　在免疫细胞化学实验中，某些物质不宜经固定剂作用或经固定剂作用后仍易丢失，而需浸泡在生理盐液中。[url=http://www.39kf.com/][img]http://www.39kf.com/Txt2Img/20061918011243.gif[/img][/url]些生理盐液的成分与正常哺乳动物血清的成分相似，能使组织离体后能处于尽量接近生理状态时的环境。Glucose通常是在用前临时加入。有的（如Kerbs液）在使用时通常需通入含CO2/O2为2.5～5%/97.5～95%的气体。这些生理盐液中的CO2和二碳酸盐，主要起缓冲作用，Glucose主要是提供离体组织有限的代谢所需的能量。

88dsz 发表于 2007-3-2 00:10

看看吧

深水 发表于 2007-3-2 21:27

奖励

ccsbb 发表于 2007-3-4 01:26

看看

赫尔戈兰 发表于 2007-3-9 11:01

坚决回复！

kkleabbs 发表于 2007-3-10 21:34

好

xuanlizi 发表于 2007-10-24 17:10

很基础

sijicc 发表于 2008-11-25 11:48

s

回复多麻烦啊!!!

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