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深水发表于 2007-3-4 11:24

蛋白质组学中的生物质谱

[color=#000000][b][font=宋体]摘要[/font][/b][font=宋体]：以基体辅助激光解析电离飞行时间质谱和电喷雾电离质谱为代表的现代生物质谱技术，为蛋白质组的研究提供了必要的技术手段，被称为蛋白质组研究的三大关键性支撑技术之一。而质谱[/font][font=Times New Roman]-[/font][font=宋体]质谱联用、质谱与其它技术联用以及高产出筛选技术的应用和发展，将使蛋白质组的研究在高准确度、高灵敏度以及大规模化水平谁的发展成为可能。[/font][/color]
[color=#000000][b][font=宋体]关键词[/font][/b][font=宋体]：蛋白质组学[/font][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]基体辅助激光解析电离飞行时间质谱[/font][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]电喷雾电离质谱[/font][/color]}'UF,__(a(| W
[font=Times New Roman][color=#000000] [/color][/font]
[color=#000000][b][font=Times New Roman]1 [/font][/b][b][font=宋体]蛋白质组定义与发展[/font][/b][/color]
[color=#000000][font=Times New Roman]2000[/font][font=宋体]年[/font][font=Times New Roman]6[/font][font=宋体]月[/font][font=Times New Roman]26[/font][font=宋体]日[/font][font=Times New Roman]6[/font][font=宋体]个国家合作的国际人类基因组计划协作组和私人基因组研究集团，同时向全世界宣布：人类基因组工作框架图已经完成。这是科学发展史上的一个重要里程碑，[/font][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]同时标志着后基因组时代[/font][font=Times New Roman] (Post-Genome Era)[/font][font=宋体]到来。[/font][/color]
[color=#000000][font=宋体]后基因组时代学术研究重点是功能基因组学[/font][font=Times New Roman] (Functional Genomics)[/font][font=宋体]，即揭示基因的生物学功能，在基因组整体水平上阐明基因活动的规律。[/font][/color]
[color=#000000][font=宋体]蛋白质组（[/font][font=Times New Roman]Proteome[/font][font=宋体]）概念是由澳大利亚科学家[/font][font=Times New Roman]Wikings[/font][font=宋体]等在[/font][font=Times New Roman]1994[/font][font=宋体]年首先提出，它是指一个基因组、一个细胞或组织表达的所有蛋白质。蛋白质组学是后基因组时代研究的一个新领域，它是通过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白质的定量研究，来揭示生命的过程和解释基因表达控制的机理。蛋白质组学分为表达蛋白质组学[/font][font=Times New Roman](Expression Proteomics)[/font][font=宋体]和细胞图谱蛋白质组学[/font][font=Times New Roman] (Cell Map Proteomics)[/font][font=宋体]。前者指细胞和组织表达的蛋白质的定量图谱，它依赖二维凝胶电泳图谱和图象分析，它能在整体蛋白质水平上研究细胞的通路，以及疾病、药物和其它生物刺激所引起的紊乱，因此它可能发现疾病标志和阐明生物通路。后者系指通过纯化细胞器或蛋白质复合物，用质谱鉴定蛋白质组分，确定蛋白质和蛋白质[/font][font=Times New Roman]-[/font][font=宋体]蛋白质相互作用的亚细胞位置。蛋白质组学是了解基因功能的最重要途径之一[/font][font=Times New Roman][1 ][/font][font=宋体]。[/font][/color]
[color=#000000][font=宋体]在生物化学和细胞生物学的领域内，通常应用一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳从生物样品中分离分析蛋白质。随着[/font][font=Times New Roman]1975[/font][font=宋体]年引入高分辨二维聚丙烯酰胺凝胶电泳[/font][font=Times New Roman] (Two-Dimensional Polyarylamide Gel Electrophoresis,2-DPAGE), [/font][font=宋体]和之后对此方法的改进[/font][font=Times New Roman][2],[/font][font=宋体]高分辨[/font][font=Times New Roman]2DPAGE[/font][font=宋体]已成为当前从复杂的生物样品中分离分析蛋白质最强有力的方法。样品中含有多至[/font][font=Times New Roman]10,000[/font][font=宋体]个蛋白质可在一次[/font][font=Times New Roman]2DPAGE[/font][font=宋体]操作中分离。传统分离后凝胶上的蛋白质，用适当的方法显色后可用免疫印记方法、氨基酸组成分析、[/font][font=Times New Roman]Edman[/font][font=宋体]降解反应的Ｎ端测序和内端测序对蛋白质进行鉴定。但是这些技术非常费时费事，而且灵敏度也不高。[/font][/color]-r:[x'}F Uw+X(e o
[color=#000000][font=Times New Roman]80[/font][font=宋体]年代后期有机质谱中出现了两种新类型的生物质谱，能高灵敏度、准确和快速的分析多肽和蛋白质。[/font][font=Times New Roman]90[/font][font=宋体]年代以来随着人类基因组计划的实施引发了生物信息学[/font][font=Times New Roman](Bioinformatics)[/font][font=宋体]的发展，使蛋白质分析发生了革命性的变化。现在将高分辨[/font][font=Times New Roman]2DPAGE[/font][font=宋体]、高灵敏度的生物质谱和快速增长的蛋白质和[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]数据库三者结合起来，为高通量的蛋白质组学[/font][font=Times New Roman](High Throughput Proteomics)[/font][font=宋体]铺平了道路。本文主要综述生物质谱技术和它在蛋白质组学中的应用。[/font][/color]
[color=#000000][b][font=Times New Roman]2[/font][/b][b][font=宋体]　生物质谱技术[/font][/b][/color]
[color=#000000][font=宋体]电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于[/font][font=Times New Roman] 80[/font][font=宋体]年代末期的两项软电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在[/font][font=Times New Roman]pmol(10 -12 )[/font][font=宋体]甚至[/font][font=Times New Roman]fmol(10 -15)[/font][font=宋体]的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速的发展。以下主要介绍与生物医学有关的几项质谱。[/font][/color]
[color=#000000][b][font=Times New Roman]2.1 [/font][/b][b][font=宋体]电喷雾质谱技术[/font][/b][/color]
[color=#000000][font=宋体]电喷雾质谱技术[/font][font=Times New Roman](Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS)[/font][font=宋体]是美国耶路大学[/font][font=Times New Roman]Fenn[/font][font=宋体]教授和他的同事在[/font][font=Times New Roman]80[/font][font=宋体]年代后期提出的，原理为在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比[/font][font=Times New Roman]([/font][font=宋体]ｍ[/font][font=Times New Roman]/[/font][font=宋体]ｚ[/font][font=Times New Roman])[/font][font=宋体]降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。现在可用软件将蛋白质的一组多电荷离子转换成通常的质谱图。[/font][/color]
[color=#000000][font=Times New Roman]ESI-MS[/font][font=宋体]的最重要进展是[/font][font=Times New Roman]Wilm[/font][font=宋体]和[/font][font=Times New Roman]Mann[/font][font=宋体]引入了纳电喷雾源[/font][font=Times New Roman] (nano electrospray ionization source,nanoESI[/font][font=宋体]，纳升流速[/font][font=Times New Roman])[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]nanoESI[/font][font=宋体]不仅提高了分析灵敏度，而且少至[/font][font=Times New Roman]0.5[/font][font=宋体]μ[/font][font=Times New Roman]L[/font][font=宋体]样品溶液，可得到[/font][font=Times New Roman]30[/font][font=宋体]多分钟的稳定喷雾，以致有充分的机会使[/font][font=Times New Roman]MS[/font][font=宋体]的参数最佳化和进行许多串联质谱分析。[/font][font=Times New Roman]ESI[/font][font=宋体]源最常用的分析器是单级四极杆分析器和三级四极分析器[/font][font=Times New Roman] (Triple Quatrupole Analyzer)[/font][font=宋体]单级四极分析器组成的[/font][font=Times New Roman]ESI-MS[/font][font=宋体]主要用于测定多肽和蛋白质的分子量。而[/font][font=Times New Roman]ESI[/font][font=宋体]源与三级四极分析器组成的串联质谱仪[/font][font=Times New Roman](ESI-MS/MS)[/font][font=宋体]，在分析混合物时有高度的专一性。在[/font][font=Times New Roman]ESI-MS/MS[/font][font=宋体]分析中，多肽混合物被[/font][font=Times New Roman]ESI[/font][font=宋体]源电离后，第一级[/font][font=Times New Roman]MS[/font][font=宋体]选择特定ｍ[/font][font=Times New Roman]/[/font][font=宋体]ｚ的多肽离子通过并进入碰撞活化室，在碰撞活化室内肽离子与惰性气体碰撞发生碰撞诱导解离[/font][font=Times New Roman](Collision Induced Disociation,CID)[/font][font=宋体]生成碎片离子，第二级[/font][font=Times New Roman]MS[/font][font=宋体]对裂解生成的碎片离子进行分析。[/font][font=Times New Roman]CID[/font][font=宋体]也可在离子源内发生[/font][font=Times New Roman], [/font][font=宋体]源内[/font][font=Times New Roman]CID[/font][font=宋体]不能选择离子故不适合混合物分析。[/font][font=Times New Roman]ESI[/font][font=宋体]产生的离子特别适合[/font][font=Times New Roman]CID[/font][font=宋体]，因为多肽的高电荷状态增加了碰撞能量。多肽[/font][font=Times New Roman]CID[/font][font=宋体]时的碎裂作用优先发生在酰胺键上，生成专一的序列离子。当酰胺键断裂形成离子时电荷保留在Ｎ端的碎片上定名为ａ，ｂ，ｃ离子，当电荷存在于Ｃ端的碎片上时称之为ｘ，[/font][font=Times New Roman]y[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]z[/font][font=宋体]离子。通常在低能裂解条件下，ｃ和ｚ离子一般观察不到。ａ离子是从相应的ｂ离子失去[/font][font=Times New Roman]CO(28Da)[/font][font=宋体]形成的。有时也可观察到亚铵离子[/font][font=Times New Roman](immonium ion)[/font][font=宋体]酰基阳离子[/font][font=Times New Roman] (Acylium ion)[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]Acylium[/font][font=宋体]离子是由二个主键链裂解产生的。Ｍ[/font][font=Times New Roman]/[/font][font=宋体]ｚ值高于母离子的离子常常是部分ｙ系列离子。在多肽的[/font][font=Times New Roman]CID[/font][font=宋体]质谱图上，通常能观察到多肽的Ｎ端和Ｃ端互补的序列离子，获得多肽完全或几乎完全的序列信息。应用[/font][font=Times New Roman]ESI-MS/MS[/font][font=宋体]测定多肽的氨基酸序列，是对Ｅｄｍａｎ降解反应测序的最好补充，因为它能测定修饰的氨基酸和封闭的末端。[/font][font=Times New Roman]ESI-MS/MS[/font][font=宋体]测得的多肽序列信息结合多肽的质量数据，在分析蛋白质翻译后的修饰时特别有用。[/font][/color]
[color=#000000][font=宋体]现在[/font][font=Times New Roman]ESI[/font][font=宋体]源已经成功地用于磁式扇型分析器、离子阱和傅立叶转换离子回旋共振分析器。[/font][font=Times New Roman]ESI-MS[/font][font=宋体]的最近发展是基于[/font][font=Times New Roman]TOF[/font][font=宋体]分析器的仪器，[/font][font=Times New Roman]ESI-TOF-MS[/font][font=宋体]较单级四极质谱仪或离子阱质谱仪有较宽的质量范围和更高的质量准确度。混合型的四极杆飞行时间质谱仪，称之为[/font][font=Times New Roman]QTOF[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]QqTOF[/font][font=宋体]，它结合了两种分析器的优点，具有显著的特点，质量准确度优于[/font][font=Times New Roman]5pp[/font][font=宋体]ｍ，应用[/font][font=Times New Roman]nanoESI-MS/MS[/font][font=宋体]时，灵敏度可低至[/font][font=Times New Roman]femtomole[/font][font=宋体]。[/font][/color]h%V g/\:}bL @
[color=#000000][font=宋体]电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液[/font][font=Times New Roman]-[/font][font=宋体]质联用[/font][font=Times New Roman](LC-MS)[/font][font=宋体]是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。[/font][font=Times New Roman]ESI-MS[/font][font=宋体]分析时样品溶液是连续不断导入[/font][font=Times New Roman]ESI[/font][font=宋体]源内的，因此[/font][font=Times New Roman]ESI[/font][font=宋体]源能直接与分离技术像[/font][font=Times New Roman]HPLC[/font][font=宋体]和毛细管区带电泳[/font][font=Times New Roman]CZE[/font][font=宋体]联用对样品进行联机分离与鉴定。最近发展起来的自动毛细管反相柱[/font][font=Times New Roman]HPLC-ESI-MS/MS[/font][font=宋体]能高通量鉴定蛋白质。[/font][/color]D KV Ha#{
[color=#000000][b][font=Times New Roman]2.2[/font][/b][b][font=宋体]　基质辅助激光解吸附质谱技术[/font][/b][/color]1T+p;mip!e
[color=#000000][font=宋体]基质辅助激光解吸附质谱技术[/font][font=Times New Roman](Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization,MALDI))[/font][font=宋体]基本原理是将分析物分散在基质分子中形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。[/font][font=Times New Roman]MALDI[/font][font=宋体]所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系，由德国科学家[/font][font=Times New Roman]Karas[/font][font=宋体]和[/font][font=Times New Roman]Hillenkamp[/font][font=宋体]发现的，他们将微量蛋白质与过量小分子基体的混合溶液点加在样品的靶盘上，溶剂挥发后蛋白质与基体在靶上形成共结晶。将靶盘装入质谱仪的离子源内，当脉冲激光照射到靶点上时，基体吸收了激光的能量跃迁到激发态，导致了蛋白质的电离和气化。电离通常是基体上的质子转移到蛋白质分子上。然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内。[/font][/color]
[color=#000000][font=Times New Roman]MALDI[/font][font=宋体]源最常用的分析器是飞行时间分析器[/font][font=Times New Roman] (TOF)[/font][font=宋体]。蛋白质离子在飞行管内的飞行速度与它的ｍ[/font][font=Times New Roman]/[/font][font=宋体]ｚ[/font][font=Times New Roman]- 1 / 2 [/font][font=宋体]成正比。因此ｍ[/font][font=Times New Roman]/[/font][font=宋体]ｚ值很容易由蛋白质离子从离子源飞行到检测器的飞行时间计算出来。在[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF-MS[/font][font=宋体]中最常用的是氮激光源[/font][font=Times New Roman] ,[/font][font=宋体]λ[/font][font=Times New Roman]=337nm[/font][font=宋体]。常用的基体有芥子酸[/font][font=Times New Roman] (sinapinic acid,SA)[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]2,5-[/font][font=宋体]二羟基苯甲酸[/font][font=Times New Roman] (2,5-dihudroxybenzoic acid, DHB)[/font][font=宋体]和α[/font][font=Times New Roman]-[/font][font=宋体]氰基[/font][font=Times New Roman]-4-[/font][font=宋体]羟基肉桂酸[/font][font=Times New Roman] ([/font][font=宋体]α[/font][font=Times New Roman]-cyano-4-hydroxycinnamic acid,[/font][font=宋体]α[/font][font=Times New Roman]cyan)[/font][font=宋体]等。也有应用红外激光即铒[/font][font=Times New Roman]/[/font][font=宋体]镱[/font][font=Times New Roman]-[/font][font=宋体]铝[/font][font=Times New Roman]-[/font][font=宋体]石榴石[/font][font=Times New Roman] (Erbium/Yttrium Aluminum Garnet,ErYAG)[/font][font=宋体]激光，其波长λ[/font][font=Times New Roman]=2.94[/font][font=宋体]μｍ。[/font][font=Times New Roman]Burlingame[/font][font=宋体]等实验证明，红外激光[/font][font=Times New Roman]MALDI[/font][font=宋体]与紫外激光[/font][font=Times New Roman]MALDI[/font][font=宋体]相比，红外激光[/font][font=Times New Roman]MALDI[/font][font=宋体]诱导的糖肽和磷酸化肽的裂解比较小，有利于鉴定整个分子。[/font][/color]DV5y2v]
[color=#000000][font=Times New Roman]MALDI-TOF-MS[/font][font=宋体]适合分析绝大多数蛋白质，特别适合分析多肽和蛋白质的混合物。常规分析时多肽的灵敏度可达[/font][font=Times New Roman]femtomol,attomol[/font][font=宋体]或更低。[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF-MS[/font][font=宋体]分析时能耐受一定量的小分子像盐、去污剂等。分析时样品制备是分析成败的关键。[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF-MS[/font][font=宋体]是蛋白质组学中蛋白质高通量鉴定的选用技术。[/font][font=Times New Roman]MALDI[/font][font=宋体]产生的离子常用飞行时间[/font][font=Times New Roman](Time-of-Flight,TOF)[/font][font=宋体]检测器来检测，理论上讲只要飞行管的长度足够，[/font][font=Times New Roman]TOF[/font][font=宋体]检测器可检测分子的质量数是没有上限，因此[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF[/font][font=宋体]质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。[/font][/color]
[color=#000000][b][font=Times New Roman]2.3[/font][/b][b][font=宋体]　同位素质谱[/font][/b][/color]X!R-\&@BA
[font=宋体][color=#000000]同位素质谱是一种开发和应用比较早的技术，被广泛地应用于各个领域，但它在医学领域的应用只是近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力，该化合物又易于用同位素标示，人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含量以达到检测该病原菌的目的，同时也为同位素质谱在医学领域的应用开辟了一条思路。[/color][/font]
[color=#000000][font=宋体]后基因组时代的研究中，需要在整体水平上准确定量测定细胞和组织的基因表达。因而定量分析和比较研究在正常、发育和疾病状态下蛋白质表达的变化是蛋白质组学中最重要的工作之一。现在定量分析研究细胞蛋白质表达的方法是[/font][font=Times New Roman]2-DPAGE[/font][font=宋体]后的考马斯蓝染色、银染色和图像分析。但这些方法不够准确，也不够可靠。用放射性标记的代谢方法可以得到比较准确的定量分析结果，但它高度依赖[/font][font=Times New Roman]2-DPAGE[/font][font=宋体]分离蛋白质的重复性。[/font][/color]0W3V0b0bRu*w:H
[color=#000000][font=宋体]在有机质谱中，稳定同位素标记内标的质谱定量分析法，由于灵敏、准确和快速，已广泛应用于体液内代谢物的分析研究。基于这一原理，[/font][font=Times New Roman]Gygi[/font][font=宋体]等人在[/font][font=Times New Roman]1999[/font][font=宋体]年[/font][font=Times New Roman]Nature Biotechnology[/font][font=宋体]发表了应用同位素编码亲和标记定量分析蛋白质混合物的新方法。在这一方法中二种不同细胞状态的蛋白质还原后，分别用正常和重氢标记的[/font][font=Times New Roman]ICAT[/font][font=宋体]试剂标记蛋白中半胱氨酸的巯基。再将两份蛋白溶液混合。此时可用任何分离技术处理，富集低丰度的蛋白质或降低混合物的复杂性。混合后的蛋白质溶液用胰蛋白酶进行酶切，再用亲和色谱通过试剂上的生物素对[/font][font=Times New Roman]ICAT[/font][font=宋体]标记的多肽进行分离，最后用毛细管柱联机的[/font][font=Times New Roman]HPLC-ESI-MS/MS[/font][font=宋体]进行分析。用质谱图上正常[/font][font=Times New Roman]ICAT[/font][font=宋体]和重氢[/font][font=Times New Roman]ICAT[/font][font=宋体]标记的一对离子的强度比例，定量分析它的母体蛋白在原来细胞状态中的相对丰度。同时[/font][font=Times New Roman]MS/MS[/font][font=宋体]谱图上出现的序列信息可对蛋白质进行明确的鉴定。[/font][font=Times New Roman]Gygi[/font][font=宋体]等用此方法在一次分析中比较了在半乳糖和乙醇两种环境下酵母生长时的蛋白质表达模型。[/font][font=Times New Roman]ICAT[/font][font=宋体]方法的优点是烷基化反应高度专一，适用范围广，若应用生化、免疫或物理的分离方法进行分离和富集，可测定低丰度的蛋白质。此方法的不足之处是[/font][font=Times New Roman]ICAT[/font][font=宋体]试剂的分子量约[/font][font=Times New Roman]500Da[/font][font=宋体]，对含半胱氨酸的多肽尤其是小于[/font][font=Times New Roman]7[/font][font=宋体]个残基的小肽是一个较大的修饰，可能会影响数据库检索。其次该方法不适合分析在蛋白质中所含比例较小的不含半胱氨酸的蛋白质。[/font][/color]Q uI1cypko
[color=#000000][font=宋体]稳定同位素标记也可在细胞培养过程中进行。[/font][font=Times New Roman]Oda[/font][font=宋体]等分别在正常培养液[/font][font=Times New Roman] ([/font][font=宋体]氮同位素分布[/font][font=Times New Roman]14[/font][font=宋体]Ｎ[/font][font=Times New Roman]99.6%, 15[/font][font=宋体]Ｎ[/font][font=Times New Roman]0.4%)[/font][font=宋体]和富[/font][font=Times New Roman]15[/font][font=宋体]Ｎ[/font][font=Times New Roman]>96%[/font][font=宋体]的培养液中培养酵母培养一定时间后两种细胞库合并，提取其中的蛋白质，先用[/font][font=Times New Roman]RP-HPLC[/font][font=宋体]分离收集再用[/font][font=Times New Roman]SDS-PAGE[/font][font=宋体]分离。分离后凝胶上的蛋白斑点进行凝胶内酶切，用[/font][font=Times New Roman]PMF[/font][font=宋体]方法对蛋白鉴定。用每个多肽一对[/font][font=Times New Roman]14[/font][font=宋体]Ｎ和[/font][font=Times New Roman]15[/font][font=宋体]Ｎ同位素离子的强度测定相对丰度。[/font][font=Times New Roman]Oda[/font][font=宋体]等测定了两个库中[/font][font=Times New Roman]42[/font][font=宋体]个高丰度蛋白质的表达，仅观察到Ｇ[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]细胞周期蛋白ＣＬＮ[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]表达有差异，实验误差[/font][font=Times New Roman] 10%[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman]Oda[/font][font=宋体]等还用相同的技术测定了酵母蛋白[/font][font=Times New Roman]Ste20[/font][font=宋体]的不同的磷酸化状态。[/font][/color]
[color=#000000][b][font=Times New Roman]2.4[/font][/b][b][font=宋体]　快原子轰击质谱技术[/font][/b][/color]
[color=#000000][font=宋体]快原子轰击质谱技术[/font][font=Times New Roman](Fast Atom Bomebardment Mass Spectrometry,FABMS)[/font][font=宋体]是一种软电离技术，是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究。[/font][/color]
[color=#000000][font=Times New Roman]FABMS[/font][font=宋体]只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而[/font][font=Times New Roman]FABMS-MS[/font][font=宋体]串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。[/font][/color]^L]7G3a(zIGqd:u
[color=#000000][b][font=Times New Roman]3. [/font][/b][b][font=宋体]生物质谱在蛋白质组研究中的应用[/font][/b][/color]Y J w ?V"s|j Ou&x X
[color=#000000][font=宋体]质谱分析已成为蛋白质组研究的一个很重要的工具。两种新的较温和的离子化方法[/font][font=Times New Roman]MALDI[/font][font=宋体]和[/font][font=Times New Roman]ESI[/font][font=宋体]，离子化时不会破坏分子的结构，使得生物大分子的质谱分析成为可能。从细胞组织以及生物液体中提取的蛋白质先进行双向解泳，所分离的蛋白斑点用蛋白酶如胰蛋白酶酶解后进行质谱分析，所得到的肽谱图可通过蛋白数据库[/font][font=Times New Roman] ([/font][font=宋体]大多数从[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]序列转译而来[/font][font=Times New Roman] )[/font][font=宋体]进行检索，以识别和筛选所检测的蛋白。这种方法称为肽质量指纹分析[/font][font=Times New Roman] (peptide mass fingerprinting)[/font][font=宋体]。目前，约[/font][font=Times New Roman]50[/font][font=宋体]～[/font][font=Times New Roman]70%[/font][font=宋体]的蛋白可通过肽质量指纹分析得到识别。[/font][/color]
[color=#000000][font=Times New Roman]MALDI-TOF[/font][font=宋体]应该是肽质量指纹分析和大规模筛选蛋白质的首选。第一，通过激发延迟和在[/font][font=Times New Roman]TOF[/font][font=宋体]中增加离子反射器，大大增加了[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF[/font][font=宋体]的分辨率和质量准确度。准确度大于[/font][font=Times New Roman]0~1[/font][font=宋体]个质量范围。第二，[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF[/font][font=宋体]对样品中所带的少量污染物，如双向电泳中的盐和去污剂等相对不太敏感，故酶解后可直接进行质谱分析。第三，大多数[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF[/font][font=宋体]可以全自动连续分析几十个到几百个样品，适合于大规模筛选。第四，[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF[/font][font=宋体]所需的样品量在[/font][font=Times New Roman]50[/font][font=宋体]～[/font][font=Times New Roman]100fmol[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]Ｄ胶中考马斯亮兰染色的蛋白斑点就足够进行分析。最后，[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF[/font][font=宋体]所得到大多数肽片段只带一个电荷，所得到的质谱图更容易解析。除此之处，[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF[/font][font=宋体]可对离子化以后的肽片段再进行源后裂解或碰撞诱发裂解，裂解后得到的小肽片断可进一步到蛋白数据库检索，并能得到氨基酸序列的信息。[/font][/color]fX H L6o1O
[color=#000000][font=宋体]还可以用由两级质谱组成的串联质谱[/font][font=Times New Roman]MS-MS[/font][font=宋体]分析得到部分肽序列帮助鉴定蛋白质。[/font][font=Times New Roman]MS-I[/font][font=宋体]产生的待测肽片段被送到碰撞室，经惰性气体[/font][font=Times New Roman] (He[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]Ar)[/font][font=宋体]碰撞，肽链中的肽[/font][font=Times New Roman]Capillary HPLC-MS[/font][font=宋体]、毛细管电泳质谱[/font][font=Times New Roman] CE-MS[/font][font=宋体]。[/font][font=Times New Roman]HPLC-MS[/font][font=宋体]法用[/font][font=Times New Roman]HPLC[/font][font=宋体]分离肽片段，然后用质谱分析。这种方法自动化程度高但灵敏度差[/font][font=Times New Roman] ,[/font][font=宋体]主要适用于分离含量在[/font][font=Times New Roman]pmol(10-12mol)[/font][font=宋体]级的蛋白质样品。[/font][font=Times New Roman]Capillary HPLC-MS[/font][font=宋体]用毛细管高压液相色谱分离肽片段，这种方法自动化程度较低但灵敏度较好，主要适用于分离含量大于[/font][font=Times New Roman]100fmol[/font][font=宋体]的蛋白质样品。[/font][font=Times New Roman]CE-MS[/font][font=宋体]用毛细管电泳分离肽片段，这种方法灵敏度最好，可以分离含量为[/font][font=Times New Roman]amol (10-18mol)[/font][font=宋体]到[/font][font=Times New Roman]fmol (10-15mol)[/font][font=宋体]之间的蛋白质样品，但自动化程度最低。[/font][/color]
[color=#000000][font=宋体]生物质谱技术灵敏度高，耗时短，已经成为一种重要的蛋白鉴定方法。但它目前只适用[/font][font=Times New Roman] 20[/font][font=宋体]个氨基酸以下的肽段，并且对[/font][font=Times New Roman]Leu[/font][font=宋体]和[/font][font=Times New Roman]Ile[/font][font=宋体]、[/font][font=Times New Roman]Lys[/font][font=宋体]和[/font][font=Times New Roman]Gln[/font][font=宋体]不能区别[/font][font=Times New Roman] ,[/font][font=宋体]对某些肽的固有序列不能用质谱法来测定。[/font][/color]
[color=#000000][font=宋体]最近几年来，生物质谱的最重要应用之一是鉴定蛋白复合物中的组分。大多数重要细胞生命过程的完成，是由许多的多蛋白复合体调控的。蛋白质复合物大多是由大量独特的蛋白质组成的。由于蛋白质鉴定的困难，许多蛋白复合物还未发现，有些复合物仅进行了部分的鉴定。蛋白质复合物的鉴定具有生物学和治疗学双重意义。[/font][font=Times New Roman]Neubauer[/font][font=宋体]等鉴定了酿酒酵母中的蛋白复合物[/font][font=Times New Roman]UlsnRNP[/font][font=宋体]鉴定了凝胶电泳纯化后复合物中含有的[/font][font=Times New Roman]0.55pmol[/font][font=宋体]的[/font][font=Times New Roman]20[/font][font=宋体]个蛋白质。[/font][font=Times New Roman]Link[/font][font=宋体]等人应用二维[/font][font=Times New Roman]HPLC-ESI_MS/MS[/font][font=宋体]鉴别酵母核糖体中的组分，在一次实验中鉴定了[/font][font=Times New Roman]80[/font][font=宋体]个蛋白质，其中的[/font][font=Times New Roman]10[/font][font=宋体]个在[/font][font=Times New Roman]2D-PAGE[/font][font=宋体]分离分析中未观察到。这一领域今后将会有更大的发展。[/font][/color]
[color=#000000][b][font=Times New Roman]4. [/font][/b][b][font=宋体]结语[/font][/b][/color]
[color=#000000][font=宋体]蛋白质组学中生物质谱在蛋白质的鉴定方面起着很重要的作用。[/font][font=Times New Roman]MALDI-TOF-MS[/font][font=宋体]的[/font][font=Times New Roman]PMF[/font][font=宋体]方法具有高通量高灵敏度和操作简便等优点，已得到了广泛的应用，但它不适合分析蛋白质的混合物。与之相比联机[/font][font=Times New Roman]HPLC-ESI-MS/MS[/font][font=宋体]虽然只有较低的高通量分析，但能取得更好的分析结果，而且适合分析蛋白质混合物和蛋白质复合物。生物质谱技术目前仍处在发展阶段，随着科技的进步，它的性能还会不断发展。人类基因组工作框架图已经完成，人类基因组工作完成图不久的将来也将出台。生命科学中可应用的基因序列越来越多，将会发展出更快更高级的检索软件，以至能直接在基因组序列中进行检索。应用蛋白芯片的蛋白样品制样微型化的研究，很有发展前景。这些发展将会使蛋白质组学成为一个强大的途径，直接在蛋白质水平上大规模的研究基因的功能。大量应用质谱技术鉴定蛋白质复合物和它的亚细胞定位，在不久的将来会取得有价值的成果。[/font][/color]Qv} N3kk;]
[font=Times New Roman][color=#000000] [/color][/font]7Cg0F0]+L
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匿名发表于 2007-3-17 09:43

好

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蛋白质组学中的生物质谱