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88dsz 发表于 2007-3-29 21:12

免疫印迹化学发光试剂（ECL Reagent）

[color=#552787][b]用途：[/b][/color]/S'`4S-je*`;X
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　　本试剂是非放射性发光系统，用于检测固定在膜上的蛋白，其敏感性达1-10pg。用X光片可快速地获得永久的硬拷贝结果。所含独特的底物足以维持数小时的发光，便于反复曝光操作，免疫印迹膜经抗体脱卸处理后可供再次抗体探查使用。0nNGo.g&o3j:R
[color=#552787][b]原理：[/b][/color]
5f+{]%|0[%A 　　辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。在免疫印迹中，将复杂的蛋白混合物经SDS-PAGE分离，并转移到固相膜上（如NC、PVDF）等，用于免疫学检测，经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）或间接（标记二抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光片（放射自显影片）感光记录下来。
0FO6E2P4CJ)[ [color=#552787][b]操作注意：[/b][/color]${QV1veDb;]
1. 本试剂每个批号均独立优化，请不要混用或稀释本试剂以免降低敏感性；
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~TeX$M 2. 加入一抗某膜不能再干燥；
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d[ c'^ 3. 适当地封闭和洗涤膜片至关重要；GN1[ nbO4c H
4. 使用前配置化学发光试剂，配置两足够覆盖膜片即可，弃去使用过的混合试剂；xt'KsXG]
5. 使用干净取样头取用每种试剂；#nih{.p3y'a2a
6. 第一张片子建议曝光30秒钟，观察结果后判断最佳曝光时间可从30秒至2小时不等； K,u2Q&Cd7p m
7. 除了放射自显影片曝光和洗片处理外，所有步骤均不必在暗室中操作；
#sQMLM5?d7A| 8. 膜片可经适当方法洗脱原有抗体，再次印迹使用，在此情况下，此试剂更为理想；"bp:qz
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9. 因为它不象生色物质需要从膜片上清除底物。Bp@Dq3N
[color=#552787][b]使用方法：[/b][/color]Zw/P#?4yg~w~
I. 印迹膜制备 按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作，适当的封闭非常重要。可以通过标记一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交联物。仔细地淋洗对于降低背景非常重要，在与HRP交联物温育后，膜片更需仔细洗涤，所有步骤均在室温下完成。"~G:ZUCO'|O.D
II. 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合A液和B液，混合后尽快使用。将膜片置混合液中于室温下振荡温育1分钟，每平方厘米膜片至少使用0.125ml以覆盖全膜片。
~l1KmP5R.H jJ6[\)jz.[W9b-u
III. 蛋白信号显现
'@]3pf W+t:l L 1. 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂。
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| 2. 置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。/l.tOxG|,JF1YHe
3. 将膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中。
E f(cy7@/tq 4. 于暗室中压上X光片。g$fL6b^F @
5. 曝光30秒，显影之。
!X2\L+dn.EUfZ 6. 调节曝光时间，再次曝光显影。 A*AM/IH*tE
IV、膜的重复使用：/D*e3\%r8Y
配置62.5mM Tris-Hcl,PH6.7,2%SDS, 7ml/100ml的巯基乙醇的溶液，胶片放入后，70?C振荡水浴30分钟。再用TBST或PBST缓冲液洗脱，最后用BSA（牛血清白蛋白）或牛奶封闭。

] pia2@[ [align=center][color=#552787][b]免疫印迹化学发光检测流程[/b][/color][/align][align=center]电泳分离样品蛋白
!V.v%s
tx5^q2V+~/s)W [color=#552787][b]↓[/b][/color]/\ t4fln
转移至固相膜
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封闭非特异结合位点 MQQ)AR#`B~!n3`"_
[color=#552787][b]↓[/b][/color]
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e+aX 与第一抗体温育反应
xN e;c(u#nw'[ [color=#552787][b]↓[/b][/color]洗涤
Ayeq~ 与HRP-第二抗体交联物温育反应^ }Mb9]M9B
[color=#552787][b]↓[/b][/color]洗涤
_W{idAvQ9J 等量混合溶液A和溶液B
HGqZ6YC M$_q5r [color=#552787][b]↓[/b][/color]1`%G:W
{$s2j)Z
与膜片温育
9lh~-Zf Q`A6cu y-^ [color=#552787][b]↓[/b][/color]
'sj"}.y7Wa X光片曝光显影[/align]

ccsbb 发表于 2007-4-6 13:31

:hug:

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