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onizuka 发表于 2007-7-19 21:26

反相高效液相色谱中缓冲体系PH值的选择

[font=宋体][size=9pt]在反相高效液相色谱分析中，选择正确的缓冲液[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值，对可离解的化合物分析的重现性十分重要，不恰当的[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值可能导致不对称峰，宽峰，分裂峰或肩峰，而尖锐的，对称的峰是定量分析中获得低的检测限以，两次分析之间较低的相对标准偏差（[/size][/font][size=9pt]RSD[/size][font=宋体][size=9pt]）和保留时间的高重现性的前提。我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值，以及如何选择正确的缓冲体系。[/size][/font]
lt}0L5_ar [font=宋体][size=9pt]什么时候需要缓冲溶液？[/size][/font]
i,aa,\~ Kx'Ur [font=宋体][size=9pt]在反相液相色谱分析中，流动相的[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值一般在[/size][/font][size=9pt]2.5[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]7[/size][font=宋体][size=9pt]之间，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值在[/size][/font][size=9pt]2.5[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]7[/size][font=宋体][size=9pt]之外时，就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的[/size][/font][size=9pt]Pka[/size][font=宋体][size=9pt]在[/size][/font][size=9pt]1[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]11[/size][font=宋体][size=9pt]之间，选择正确的缓冲液[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。[/size][/font]bu,t,el2_&wW
[font=宋体][size=9pt]如何选择缓冲液[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值[/size][/font],H
b9X2@(O8N)]-G
[font=宋体][size=9pt]在选择缓冲液[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值之前，应先了解被分析物的[/size][/font][size=9pt]Pka[/size][font=宋体][size=9pt]，高于或低于[/size][/font][size=9pt]Pka[/size][font=宋体][size=9pt]两个[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从[/size][/font][size=9pt]HH[/size][font=宋体][size=9pt]公式：[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]＝[/size][/font][size=9pt]Pka[/size][font=宋体][size=9pt]＋[/size][/font][size=9pt]log[/size][font=宋体][size=9pt]（[/size][/font][size=9pt][A-]/[A][/size][font=宋体][size=9pt]）得知，溶液[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值高于或低于[/size][/font][size=9pt]Pka[/size][font=宋体][size=9pt]两个单位，化合物中[/size][/font][size=9pt]99[/size][font=宋体][size=9pt]％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。[/size][/font]fMM'n `$kFg@
[font=宋体][size=9pt]让我们通过一个例子来看如何选择[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值[/size][/font]
/L ].\UBAvX ^7N,Z [font=宋体][size=9pt]例如苯甲酸图（一）[/size][/font]&l Q~f/_4Ozm+fC
[font=宋体][size=9pt]图（一）[/size][/font]_i9m9a;T`
[font=宋体][size=9pt]显示的是它的离子形式和中性化合物的转变，苯甲酸的[/size][/font][size=9pt]Pka[/size][font=宋体][size=9pt]等于[/size][/font][size=9pt]4.2[/size][font=宋体][size=9pt]，理论上由[/size][/font][size=9pt]HH[/size][font=宋体][size=9pt]公示得知，当溶液[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值等于[/size][/font][size=9pt]2.2[/size][font=宋体][size=9pt]时，[/size][/font][size=9pt]99[/size][font=宋体][size=9pt]％的苯甲酸以中性化合物存在，[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值等于[/size][/font][size=9pt]6.2[/size][font=宋体][size=9pt]时[/size][/font][size=9pt]99%[/size][font=宋体][size=9pt]的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值等于[/size][/font][size=9pt]2.2[/size][font=宋体][size=9pt]时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，表[/size][/font][size=9pt]1[/size][font=宋体][size=9pt]列出了一般缓冲液和他们的缓冲范围。从表[/size][/font][size=9pt]1[/size][font=宋体][size=9pt]知磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能用于[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值等于[/size][/font][size=9pt]2.2[/size][font=宋体][size=9pt]。[/size][/font]@nl@"U0X {,C
[font=宋体][size=9pt]表[/size][/font][size=9pt]1
-B/^m0e/?*lEA Phosphate  
R\o'|hg*v Pka12.11.1[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]3.1
9g1U3[%xj2idz Pka27.26.2[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]8.2
*w5t o.Vuh5P1~ Pka312.311.3[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]13.30q
yV4X8T
Y
P1w
Citrate  
(G
Z'c/X0v Pka13.12.1[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]4.1/E+U n:O7j ]+t
Pka24.73.7[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]5.7
+g N n0_}.~N Pka35.44.4[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]6.4
[%QK:L#c3fH$KKXL Formate3.82.8[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]4.84t_v3t1Fw
Acetate4.83.8[/size][font=宋体][size=9pt]－[/size][/font][size=9pt]5.86];T.m%\F`l5M7y
Tris[/size][font=宋体][size=9pt]（[/size][/font][size=9pt]hydroxymethyl[/size][font=宋体][size=9pt]）[/size][/font][size=9pt]aminomethane8.37.3-9.3
ow{!vj&\8z(qz ammonia9.28.2-10.2'sm,gc*x `
borate9.28.2-10.2"i4QHU/p8s}G
diethylamine10.59.5-11.58R7Aw_X2C]&J t4u y
$BG9p+U9X L6~aK O
Wt)F(HXd&l@TD p
[/size][font=宋体][size=9pt]当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数氨基化合物在[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值小于[/size][/font][size=9pt]9[/size][font=宋体][size=9pt]时都被质子化，所以所有[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值在[/size][/font][size=9pt]7[/size][font=宋体][size=9pt]或更低的溶液均适合应用，你也许会问水的[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值大约是[/size][/font][size=9pt]7[/size][font=宋体][size=9pt]，为什么还用缓冲盐，因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表[/size][/font][size=9pt]1 [/size][font=宋体][size=9pt]可值，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值等于[/size][/font][size=9pt]3[/size][font=宋体][size=9pt]的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。[/size][/font]\L
Z cK&u!z@.L
[font=宋体][size=9pt]在上面两个例子中，[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]＝[/size][/font][size=9pt]3[/size][font=宋体][size=9pt]的磷酸钾盐都能获得良好的应用，在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。[/size][/font]
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_uJQ [font=宋体][size=9pt]为离子对试剂选择缓冲液[/size][/font]L6fS._Mke4x
[font=宋体][size=9pt]为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的，离子对试剂例如四丁基铵的盐，十四烷基磺酸钠等，在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对，在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。[/size][/font] {Y K*[m]-l
[font=宋体][size=9pt]应用缓冲液[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值来调节方法选择性[/size][/font]
4t^6Q{)_i3Q$@o [font=宋体][size=9pt]如前面提到的，氨基化合物的保留随[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]的减小而降低，这个特性可以用来调节方法的选择性，如果两个化合物共流出，一个含有氨基，适当改变[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值就可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值，所以变化[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值也可以用来鉴别未知化合物的官能团，如果[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]值变小，出峰便快，则化合物中可能存在氨基，当[/size][/font][size=9pt]PH[/size][font=宋体][size=9pt]变大[/size][/font][size=9pt],[/size][font=宋体][size=9pt]化合物出峰很快，或流出在死时间处，化合物可能是一种羧酸，因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。[/size][/font]
]
N^-_.PF N8Y4_ [font=宋体][size=9pt]总结[/size][/font]8~:q+u7xt0U-[|
[font=宋体][size=9pt]正确选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰，捡出限，以及获得稳定的保留时间十分重要，如果你知道化合物官能团信息和化合物的[/size][/font][size=9pt]Pka[/size][font=宋体][size=9pt]值这一过程将十分简单[/size][/font]

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